药学1区 | 代谢组学整合网药探究香芍散结口服液治疗大鼠乳腺增生的作用机制

【写在前面】：本期推荐的是由陆军军医大学大坪医院研究团队近期发表于Journal of Ethnopharmacology(IF=4.8）的一篇文章，揭示整合代谢组学与网络药理学探究香芍散结口服液治疗大鼠乳腺增生的作用机制。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

Integrating metabolomics and network pharmacology to explore the mechanism of Xiangshao Sanjie Oral Liquid in treating rats with mammary gland hyperplasia

民族药理学相关性：香芍散结口服液（XSSJ）是一种传统中药方剂，临床上用于治疗乳腺增生（MGH），但其作用机制尚不明确。

研究目的：本研究旨在通过血浆代谢组学和网络药理学的综合策略，探讨XSSJ对MGH的治疗机制。

材料与方法：建立MGH大鼠模型，并采用多项指标进行疗效评估。随后，通过代谢组学策略寻找可能在诱导MGH中起重要作用的血浆代谢物和代谢途径。此外，采用超高效液相色谱-串联四级杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）和网络药理学分析，鉴定XSSJ在大鼠血浆中的原型化合物及可能起效的靶基因。最后，通过实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和西方印迹法（Western Blot，WB）对结果进行整合和验证。

结果：XSSJ对MGH具有治疗作用。通过代谢组学研究，鉴定了XSSJ在治疗MGH过程中的29种差异代谢物。给予XSSJ后，在大鼠血浆中发现了16种原型化合物，这些化合物与179个潜在治疗靶点相关。综合分析表明，XSSJ可逆转MGH大鼠中EGFR、ESR1、AKT1、SRC和PTPN11的mRNA表达。此外，不同剂量的XSSJ抑制了p-PI3K和p-AKT蛋白的表达。

结论：本研究结合代谢组学和网络药理学，揭示了XSSJ通过PI3K/AKT通路对MGH的调控作用，为进一步支持XSSJ的临床应用提供了依据。

（图文摘要）

【前言】

民族药理学相关性：香芍散结口服液（XSSJ）是一种传统中药方剂，临床上用于治疗乳腺增生（MGH），但其作用机制尚不明确。

研究目的：本研究旨在通过血浆代谢组学和网络药理学的综合策略，探讨XSSJ对MGH的治疗机制。

材料与方法：建立MGH大鼠模型，并采用多项指标进行疗效评估。随后，通过代谢组学策略寻找可能在诱导MGH中起重要作用的血浆代谢物和代谢途径。此外，采用超高效液相色谱-串联四级杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）和网络药理学分析，鉴定XSSJ在大鼠血浆中的原型化合物及可能起效的靶基因。最后，通过实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和西方印迹法（Western Blot，WB）对结果进行整合和验证。

结果：XSSJ对MGH具有治疗作用。通过代谢组学研究，鉴定了XSSJ在治疗MGH过程中的29种差异代谢物。给予XSSJ后，在大鼠血浆中发现了16种原型化合物，这些化合物与179个潜在治疗靶点相关。综合分析表明，XSSJ可逆转MGH大鼠中EGFR、ESR1、AKT1、SRC和PTPN11的mRNA表达。此外，不同剂量的XSSJ抑制了p-PI3K和p-AKT蛋白的表达。

结论：本研究结合代谢组学和网络药理学，揭示了XSSJ通过PI3K/AKT通路对MGH的调控作用，为进一步支持XSSJ的临床应用提供了依据。

【结果】

1. XSSJ对MGH模型的药效学结果

为评估XSSJ对MGH的影响，我们全面检查了几个关键参数，包括测量乳头直径和乳头高度的变化，以及分析子宫指数和血清性激素水平。与NC组相比，MGH模型中乳头直径（图_2B，p<0.01）、乳头高度（图_2C，p<0.01）和子宫指数（图_2D，p<0.05）均显著增加。相反，在用不同剂量的XSSJ治疗后，乳头高度、乳头直径和子宫指数呈剂量依赖性降低，接近NC组。

苏木精-伊红染色结果显示，NC组乳腺组织无异常增生，腺泡数量极少，几乎无扩张，乳腺导管和管腔无分泌物（图_2E）。MGH组乳腺组织显著增生，乳腺小叶体积增大，腺泡数量增加，接近融合，腺泡和管腔扩张且分泌过多（图_2E）。然而，经XSSJ治疗后，MGH症状显著改善，乳腺小叶体积、腺泡数量和管腔分泌均显著减少。同时，MGH组血清中的雌二醇、孕酮和催乳素水平显著升高（图_2F、G、H，p<0.01，MGH与NC组相比）。经不同剂量的XSSJ治疗后，血清中的雌二醇、孕酮和催乳素水平显著改善。

2. 代谢组学分析

通过使用QC样品确认了分析方法和仪器的稳定性和重现性。无监督PCA结果显示，所有QC样品在评分图上均在±2 STD范围内（图_3A、B），表明整个分析过程中仪器稳定性良好。

从代谢组学数据得出的主成分分析（PCA）图显示，MGH组与NC组之间有明显分离（图_3C、D）。这种清晰的分界表明MGH模型已成功建立，支持了实验设计的有效性和两组之间代谢谱的差异。此外，XSSJ-H组的位点与NC组有一定程度的重叠，表明两组之间有显著的空间关系。这种接近性与生物化学和组织学分析的结果一致，进一步证实了观察到的效果的有效性。这些结果表明，XSSJ-H组对MGH大鼠的代谢紊乱有积极影响，突出其潜在的治疗价值。

采用监督正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型来识别正常对照（NC）组与乳腺增生组（MGH）之间的代谢变化，以及MGH组与XSSJ-H治疗组之间的代谢变化。为评估模型性能，使用了参数R²Y和Q²。R²Y表示模型的拟合优度，揭示模型对数据中变异的解释程度；Q²评估模型的预测能力，反映其将发现推广到独立数据集的能力。结果显示，R²Y和Q²的值接近1，表明OPLS-DA模型拟合适当，在代谢组学变量评估中具有强大的预测能力（图_4）。同时，进行了200次置换检验以评估OPLS-DA模型的稳健性。分析显示，所有计算出的Q²斜率均低于零，表明OPLS-DA模型没有过拟合，如图_4A2、B2、C2、D2所示，这证实了模型的可靠性和有效性。

3.3. 差异代谢物的筛选与鉴定

在代谢组学分析中，根据VIP>1和P<0.05的参数，我们筛选了NC组与MGH组之间以及XSSJ-H组与MGH组之间的差异代谢物。在NC组和MGH组之间共鉴定出67种差异代谢物。然而，XSSJ治疗部分逆转了雌激素和孕激素诱导的乳腺增生的代谢变化，消除了MGH大鼠的29种代谢变化，其中11种代谢物下调，18种上调。因此，这29种差异代谢物被确定为与MGH治疗相关的关键生物标志物。各组间生物标志物的趋势如补充表2所示。此外，我们制作了热图，以展示不同组间潜在生物标志物相对丰度的差异，如图_5A所示。分析显示，NC组和MGH组在颜色表示上有显著区别，而XSSJ-H组的颜色模式与NC组非常相似。这表明，XSSJ-H治疗有效逆转了这些代谢物的变化，突显了干预措施的有效性。

4.我们使用MetaboAnalyst 6.0研究与XSSJ治疗MGH相关的差异代谢物所调控的代谢途径。在影响值>0.01的参数下，共富集到10条代谢途径，其中6条被认定为关键代谢途径（图_5B和补充表3），包括亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、初级胆汁酸生物合成、脂肪酸生物合成、类固醇激素生物合成（图_5B和补充表3）。

5. XSSJ在血浆中的原型分析

通过文献回顾、内部数据库、参考标准品和匹配MS/MS碎片规则，初步鉴定了XSSJ的原型化合物。通过UPLC-Q-TOF-MS在XSSJ中检测到88种化合物，这些化合物在以往研究中已有涉及。其中，有16种原型化合物通过UPLC-Q-TOF-MS被明确鉴定出来。结果列于表2中，而大鼠血浆样本在给予XSSJ后的总离子色谱图如图_6所示。

6. 网络药理学分析结果

6.1. 原型成分及MGH的治疗靶点获取

给予XSSJ后，在血浆中鉴定出16种原型化合物，并通过网络药理学进行分析。将这些原型化合物上传至TCMSP、HERB和Swiss Target Prediction数据库，共鉴定出468个与原型化合物相关的靶点。为了确定与疾病相关的靶点，以“乳腺增生”为关键词进行搜索，从GeneCards和OMIM等权威数据库中提取了3695个与乳腺增生相关的靶点。通过维恩图分析，发现原型化合物靶点与乳腺增生靶点之间有179个共同靶点，这些靶点被认为是XSSJ治疗MGH的潜在治疗靶点（图_7A）。

6.2. 化合物-靶点-疾病网络构建

通过Cytoscape软件3.7.2构建了16种原型化合物、179个潜在治疗靶点和MGH之间的C-T-D网络。如图_7B所示，该网络包含196个节点（16个化合物节点、1个疾病节点和179个靶点节点）和1109条边。黄色菱形代表原型化合物，蓝色椭圆代表XSSJ在MGH治疗中的潜在治疗靶点，红色八边形代表MGH。节点的度值（即其连接数）反映了节点的重要性。其中，木犀草素的度值为40，在所研究的化合物中最高（补充表4），这表明木犀草素是治疗MGH的主要活性成分，与之前关于木犀草素在乳腺癌治疗中关键作用的研究一致。

6.3. 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建

将179个潜在治疗靶点整合到STRING数据库中，构建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。去除未与网络连接的节点后，PPI网络由158个不同节点和617条连接边组成（图_7C）。然后使用CytoHubba插件筛选出中心基因（图_7D）。确定的十个主要基因为表皮生长因子受体（EGFR）、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基α（PIK3CA）、蛋白激酶B（AKT1）、SRC原癌基因（SRC）、蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型11（PTPN11）、磷脂酰肌醇-3-激酶调节亚基1（PIK3R1）、信号转导和转录激活因子3（STAT3）、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基δ（PIK3CD）、雌激素受体1（ESR1）和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基β（PIK3CB），这些基因被认为是XSSJ在MGH治疗中的中心基因。

6.4. GO和KEGG富集分析

使用DAVID 6.8数据库，通过FunRich软件对潜在靶点进行GO富集分析。图_7E-G显示了在细胞组分（CC）、生物过程（BP）和分子功能（MF）中排名前十的富集项。细胞组分主要包括血浆膜、细胞质、细胞核等；生物过程包括磷酸化、信号转导等；分子功能包括蛋白质结合、ATP结合等。KEGG富集分析排名前20的通路如图_7H所示，主要涉及PI3K-AKT信号通路等，其中PI3K-AKT信号通路是最显著富集的。值得注意的是，类固醇激素生物合成等通路也显著富集，与血浆代谢组学分析结果部分一致。

7. 构建化合物-靶点-代谢物网络并筛选关键靶点

为深入了解XSSJ在MGH治疗中的作用，通过代谢组学和网络药理学的协同分析，构建了化合物-靶点-代谢物（C-T-M）网络。在基因-代谢物关系分析中，将29种差异代谢物和179个潜在治疗靶点输入MetaboAnalyst 6.0，筛选后去除7种代谢物和82个无连接的潜在治疗靶点，最终保留22种代谢物和97个关键靶点，并构建了基因-代谢物（GM）网络（图_8A）。随后，将16种原型成分、97个关键靶点和22种代谢物整合到Cytoscape 3.7.2中，构建C-T-M网络（图_8B）。这些关键靶点与PPI网络筛选出的前十中心基因相交集，红色椭圆代表与中心基因重叠的关键靶点。因此，EGFR、ESR1、AKT1、SRC和PTPN11被确定为XSSJ治疗MGH最相关的基因，并进一步验证。

8. XSSJ对MGH中EGFR、ESR1、AKT1、SRC和PTPN11 mRNA表达的影响

通过RT-qPCR进一步检测乳腺组织中EGFR、ESR1、AKT1、SRC和PTPN11的mRNA表达水平。如图_9所示，与NC组相比，MGH组中这些基因的表达显著增加，而XSSJ处理显著逆转了这些关键靶点的表达。这些结果表明，XSSJ可能通过调节EGFR、ESR1、AKT1、SRC和PTPN11来缓解MGH。

9. XSSJ对MGH中PI3K和AKT蛋白表达水平的影响

采用西方印迹法检测PI3K和AKT蛋白的表达水平。如图_10所示，与NC组相比，MGH组中p-PI3K和p-AKT蛋白水平显著增加（P<0.01）。经XSSJ处理后，p-PI3K和p-AKT的表达水平显著降低，表明XSSJ可能通过调节PI3K和AKT蛋白的表达来减轻MGH。

10. 分子对接验证

采用分子对接Vina考察活性化合物与关键靶点的潜在相互作用。将EGFR、ESR1、AKT1、SRC和PTPN11五个关键靶点与活性化合物进行分子对接，这些靶点蛋白的结合能和结合类型如表3所示，对接结果如图_11A所示。一般来说，配体-受体结合能越低，构象越稳定，通常将结合能为−5.0 kcal mol−1视为基准。以木犀草素和关键靶点为例，配体化合物与ESR1的氨基酸残基W393和E353形成氢键（图_11B），木犀草素在EGFR中形成两个氢键，分别为K836和G833（图_11C）。木犀草素和AKT1通过K268氢键相互作用（图_11D），PTPN11和木犀草素结合到R362、W423、R465、G427、Q506和Q510的氢键网络（图_11E）。木犀草素和SRC通过K356氢键相互作用（图_11F）。对接结果表明，XSSJ中的活性化合物对MGH的主要靶点具有较强的结合亲和力。

乳腺增生（MGH）是一种常见的乳腺疾病，给众多女性带来身体和情感上的困扰。此外，长期MGH可能增加乳腺癌的风险。根据中医理论，MGH的发生与激素失衡、肝郁、气滞以及痰瘀血行问题密切相关。香芍散结口服液（XSSJ）具有平肝解郁、养血柔肝、活血化瘀、理气止痛以及清热散结的功效，与MGH的发病机制相契合。尽管XSSJ处方中的一些中药已被证明对MGH具有临床疗效，但解释XSSJ的作用机制仍是一个重大挑战，这主要是由于MGH病因复杂，以及中药治疗涉及多种化合物、靶点和途径。在本研究中，采用大鼠模型评估了XSSJ对MGH的影响。给予XSSJ和他莫昔芬后，多种生化和病理指标均显著改善。这些药效学结果为XSSJ治疗MGH的应用提供了有力支持。

在中药研究领域，口服给药是一种非常常见的给药途径。众所周知，只有进入血液循环的化合物才能发挥有效的药理作用。为了筛选活性化合物，采用超高效液相色谱-串联四级杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）技术检测XSSJ灌胃后大鼠血浆中吸收的原型化合物。最终成功鉴定了16种成分，包括木犀草素、甘草酸、橙皮苷、芍药苷、丹参酸A、橙皮素等。雌激素和孕酮的失衡是乳腺增生发病机制的关键因素。现有研究表明，木犀草素能有效抑制雌激素合成过程，通过减少雌激素合成，可有效阻止雌激素依赖性细胞的异常增殖。橙皮素和橙皮苷能显著影响雌激素信号通路中的基因表达，从而抑制乳腺癌细胞的增殖。甘草酸和甘草次酸具有抗雄激素和雌激素样活性，很可能在乳腺增生的病理过程中发挥重要作用。此外，丹参酸A、木犀草素、芍药苷、橙皮素和原阿片碱等化合物均可作用于PI3K/AKT信号通路。通过阻断PI3K/AKT通路，它们能抑制细胞增殖并促进细胞凋亡，从而有效抑制乳腺增生。这些途径和靶点与本文研究密切相关。尽管目前关于某些化合物在乳腺增生治疗中的直接应用研究相对较少，且大多数研究集中在乳腺癌等相关领域，但这些化合物的作用机制研究成果仍为乳腺增生的治疗提供了极具价值的参考。

代谢组学是研究细胞和生物体代谢产生小分子的学科，这些小分子反映了生物系统中复杂的生化反应结果。在MGH情况下，机体的代谢平衡可能改变，血浆代谢组学能够捕捉到这些变化，为了解MGH的病理生理过程提供线索。过去的研究表明，影响MGH进展的重要生物标志物包括脂肪酸、氨基酸、胆汁酸、类固醇。在本研究中，共鉴定了29种差异代谢物，涉及多条代谢途径。其中，初级胆汁酸生物合成和类固醇激素生物合成是XSSJ作用于MGH的关键代谢途径。众所周知，胆汁酸与胆固醇的合成、吸收和代谢密切相关。胆固醇作为雄激素合成的前体，间接调节雌激素的产生，从而对乳腺组织的各种生理和病理功能产生重大影响。通常，雌二醇水平升高常伴有胆汁酸水平升高。胆汁酸水平升高可直接促进法尼醇X受体的表达，同时抑制雌激素硫酸转移酶的转录，最终导致雌二醇水平进一步升高，加重MGH程度。另一方面，在乳腺增生的发病机制中，胆汁酸代谢与PI3K/AKT信号通路之间的联系不容忽视。许多研究文献报道，各种胆汁酸能够激活PI3K/AKT通路。在本研究中，我们关注初级胆汁酸生物合成，发现MGH大鼠中胆酸和甘氨胆酸水平显著升高。根据Jiang等人和Mott等人的研究成果，胆酸和甘氨胆酸能够激活PI3K/AKT信号通路，导致细胞异常增殖。值得注意的是，在本研究中，MGH大鼠的激素水平以及相关雌激素受体（ESR）及其下游PI3K/AKT基因的表达显著升高。然而，经XSSJ治疗后，这些指标显著下降。这一结果进一步强调了代谢组学在MGH中富集途径的重要性。

然而，仅用代谢组学来解释复杂的疾病机制和药物作用机制相对困难，因为代谢变化可能是多种因素共同作用的结果，难以识别特定的靶点和信号通路。因此，需要结合网络药理学技术。

网络药理学领域为中药研究提供了新的视角和方法。利用基于网络药理学的系统视角，从分子水平上阐明了XSSJ治疗MGH的机制。通过代谢组学治疗调控，可以进一步利用网络药理学识别关键治疗靶点。代谢组学和网络药理学的结合可以将差异代谢物的靶点与药物靶点联系起来，揭示疾病的干预机制。在本研究中，代谢组学结合网络药理学分析表明，表皮生长因子受体（EGFR）、雌激素受体1（ESR1）、蛋白激酶B（AKT1）、SRC原癌基因（SRC）和蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型11（PTPN11）是XSSJ治疗MGH的关键靶点。

EGFR主要参与细胞的生长、增殖和分化。根据Lu等人的研究，激素水平的变化可能激活其表达，进而激活PI3K-AKT信号通路，导致细胞增殖。ESR1与激素有直接且密切的关系，是雌激素的主要受体之一。雌激素通过与ESR1结合，触发多种信号转导途径，影响细胞生长、分化和凋亡等生理功能。例如，在乳腺组织中，雌激素与ESR1结合后可促进乳腺细胞的增殖，这与MGH和乳腺癌的发生发展密切相关。ESR1位于PI3K-AKT信号通路的上游，可通过SRC基因传递，从而激活PI3K-AKT信号通路。PTPN11可能通过调节相关蛋白的磷酸化状态影响激素信号的传递，但这种关系并非直接的激素效应。另一方面，PTPN11存在于细胞中，可直接作用于PI3K，通过去磷酸化影响PI3K-AKT通路，导致MGH。SRC在许多细胞信号过程中发挥作用，激素可能通过影响其他信号通路间接影响SRC的活性。已有研究表明，雌激素可能通过激活某些信号通路影响SRC的磷酸化状态和活性，参与肿瘤细胞生长和转移等过程。此外，针对SRC激酶的抑制剂ZD6474能够抑制MCF-7乳腺癌细胞的生长，其机制可能是通过上调E-钙黏蛋白表达、下调β-连环蛋白表达以及削弱Snail启动子的转录活性，从而抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移。SRC可直接结合并激活PI3K。在此过程中，SRC通过磷酸化PI3K的调节亚基增强其脂质激酶活性，促使其将磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）转化为磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作为第二信使，可招募并激活AKT1。AKT1（丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶AKT）在细胞内信号传导中发挥重要作用，激素可通过激活上游信号分子调节AKT1的活性。AKT1在ErbB2诱导的乳腺肿瘤发生中起关键作用。AKT1缺乏会延缓肿瘤生长，减少肺转移，并降低乳腺上皮肿瘤细胞的大小和增殖能力，同时影响细胞周期相关蛋白的表达以及细胞的迁移和极性。AKT1促进乳腺肿瘤细胞的增殖和葡萄糖代谢。综上所述，这5个关键上游靶点在XSSJ对MGH的治疗效果中发挥重要作用。

此外，根据KEGG富集分析结果，潜在靶点最显著的富集通路是PI3K-AKT信号通路。5个关键靶点均与该通路相关。因此，采用西方印迹法检测相关关键靶点（PI3K和AKT）的蛋白表达水平。如图10所示，MGH组总PI3K和AKT蛋白表达水平不变，而p-PI3K和p-AKT蛋白表达水平较NC组升高。XSSJ处理显著逆转了雌二醇和孕酮联合诱导的MGH中p-PI3K和p-AKT表达上调。

为深入探索XSSJ治疗MGH的可能活性成分，将这些原型化合物与上述5个关键靶点进行对接。对接实验结果表明，XSSJ血浆原型成分与MGH相关的关键靶点具有较强的结合亲和力。这一发现意义重大，因为它突显了这五个上游靶点在介导XSSJ对MGH治疗效果中的重要性。它们的高亲和力表明，XSSJ与这些靶点的相互作用可能是该药物治疗这种疾病疗效的基础。

【结论】

本研究采用整合代谢组学和网络药理学的方法，深入探究了XSSJ治疗MGH的作用机制。通过综合分析，确定了五个关键靶点和一条信号通路，即表皮生长因子受体（EGFR）、雌激素受体1（ESR1）、蛋白激酶B（AKT1）、SRC原癌基因（SRC）、蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型11（PTPN11）以及磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路。这些发现有助于我们更好地理解XSSJ治疗MGH的复杂分子机制，并为其临床应用提供了准确可靠的依据。

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