北京
转自：优宁维抗体专家
上周四，Cytiva和优宁维共同举办的标签蛋白纯化实战秘籍活动第一场——His标签蛋白纯化实验细节及案例分享正式开讲啦！很多小伙伴在直播间和我们热烈互动，恭喜几位小伙伴获得了我们的精美咖啡壶和小优晴雨伞等礼品！
在第一场讲座中，两位纯化专家手把手教大家拆解了His标签纯化全流程：
亲和层析原理深度解析
实验前必做的准备工作
层析柱选择与洗脱条件优化
经典案例深度剖析常见问题
错过了这场直播？不用担心，His标签纯化的小技巧已经为你整理好了！
Q1
想要纯化一个蛋白，是否应立即开始纯化实验操作？
A1
不用着急立刻实验，在实验开始前，应该先确定目标蛋白的性质，例如分子量，等电点，可溶性，稳定性等等，这些数据可以查找相关的文献或者Uniprot等蛋白数据库；
其次，还应该确定纯化目标，不同用途对于纯化的蛋白量，纯度，活性和均一性都有不同要求；
最后，还需要根据CIPP层析策略设计纯化方案，合理利用每个层析方法的特点，提高蛋白的纯度和减少蛋白蛋白损失。
Q2
一个完整的亲和层析实验包括哪些步骤？
A2
亲和层析的实验步骤一般分为5个阶段，包括平衡、上样、洗杂、洗脱、再生。
Q3
His标签蛋白纯化结合缓冲液中也要加咪唑？
A3
是的，我们建议您在结合缓冲液中也可以加入少量的咪唑（20-40mM），以减少杂蛋白的非特异性吸附。
Q4
如何提高His标签蛋白纯化的纯度？
A4
可以尝试：
（1）使用线性洗脱的方式：500 mM咪唑，0%-100%线性梯度洗脱10 CV；
（2）在镍柱纯化之后增加离子交换和分子筛等步骤继续纯化；
（3）结合缓冲液中加入少量咪唑；
（4）其他考虑方向包括His标签蛋白被部分降解，优化结合和洗脱条件，尝试不同金属离子螯合的填料，构建双标签蛋白，添加去垢剂，还原剂等添加剂破坏杂质和目的蛋白间的相互作用等等
Q5
Ni Sepharose excel和Ni Sepharose HP、FF有什么区别，如何选择？
A5
这3款填料都是Cytiva非常经典的His标签纯化产品，各有特点：
（1）HP（High Performance）
高性能，填料平均颗粒粒径约34 μm，更细的颗粒能带来更高分辨率的分离纯化。经过HP纯化后样品峰更窄，浓度高且收集体积小，节省了后续浓缩步骤的时间。
（2）FF（Fast Flow）
快流速，填料平均颗粒粒径约90 μm，具有良好的分辨率及轻松实现规模扩大的分离纯化，更适用于Batch/重力流下的蛋白纯化和多孔板筛选。
如果纯化包涵体蛋白较多，可以优先考虑FF或FF Crude（样品可无需过滤直接上样Crude预装柱，大大节省样品的前处理时间）。
（3）Ni Sepharose Excel
镍脱落极低，而且能耐受100 mM EDTA。适合真核分泌表达的蛋白，同时可以直接不脱镍进行碱洗。
Q6
Ni Sepharose FF、HP、Excel 应该如何清洁再生？
A6
（1）对于Ni Sepharose FF、HP：· 首先需要用20 mM sodium phosphate，500 mM NaCl，50 mM EDTA，pH 7.4 脱镍；
· 再按CIP protocols进行清洗（不脱镍直接上碱洗可能会产生棕色沉淀导致柱子堵塞）；
· 脱镍后可以用0.5-1 M NaOH清洗+水洗，再用100 mM NiSO4挂镍；
· 结束后先水洗，保存在20%乙醇中。
（2）对于Ni Sepharose Excel：
无需脱镍可以直接用0.5-1 M NaOH进行清洗+水洗。
（转自：优宁维抗体专家）
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