Metabolic Engineering | 利用生物质糖实现聚酰胺12的绿色合成

人工合成的聚酰胺作为一类重要的工业材料，在汽车制造、输油管道、电子电器、运动器材及医疗等行业具有广泛应用，全球市场规模超过1000亿元人民币。中国作为全球最大的聚酰胺材料消费市场，年需求量达数百万吨。然而，合成聚酰胺12的核心化学单体长期以来被少数几家公司垄断，给企业带来较大的供应风险。此外，聚酰胺12的合成依赖于石油提取，且生产过程对环境污染较大，因此，开发更加绿色、可持续的聚酰胺12合成技术显得尤为必要。

近日，由中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所合成生物化学研究中心的Howard H. Chou课题组在Metabolic Engineering期刊上发表了题为Biosynthesis of 12-aminododecanoic acid from biomass sugars的重要研究成果。

生物合成聚酰胺12的化学单体12-氨基十二烷酸 （ADDA） 面临两大技术瓶颈：其一，中间体十二烷酸 （DDA） 对底盘细胞具有毒性；其二，过氧化副产物十二烷二酸 （DDDA） 的积累会降低产率且增加生产成本。本研究基于合成生物学原理，阐明了这两个技术瓶颈的机制，并开发了高产菌株。该项研究不仅深化了对DDA、ADDA和DDDA生物合成机理的理解，还为多种聚酰胺的绿色生产提供了新思路。

生物合成ADDA的研究目前主要使用植物油作为原料，面临原料价格高、与食品生产形成资源竞争以及伴生的温室气体排放与生物多样性破坏等多种挑战。此外，生物合成ADDA的过程中会积累大量的DDDA，其合成机制至今尚不明确 （Schrewe et al., 2013；Ladkau et al., 2016；Ahsan et al., 2018） 。尽管已有研究利用葡萄糖合成了471.5 mg/L的ADDA，但DDA的细胞毒性问题仍限制了产量和产率的提升 （Ge et al.，2025） 。

虽然生物合成ADDA为聚酰胺12的可持续生产提供了新范式，但要实现绿色合成，仍需解决原料选择、DDDA积累以及DDA细胞毒性等问题。

解决DDA的细胞毒性问题

DDA添加和硫酯酶 （UcfatB） 表达实验表明，DDA对在生长中的细胞具有毒性，并提示过度的UcfatB表达会导致细胞进入不利于合成DDA的状态。研究推测，利用群体感应表达 （QSE） 系统可能有助于调节UcfatB表达，从而促进DDA的合成。在细胞密度较低时，QSE系统可以在细胞较敏感的早期生长阶段将UcfatB表达维持在较低水平，避免细胞毒性，同时实现DDA的积累。随着细胞密度的增加，在敏感阶段过后再提高UcfatB表达，可以最大化DDA的产量。与组成型表达系统相比，使用QSE系统在不诱导细胞毒性的情况下提高了DDA的产量。通过结合烷烃转运蛋白 （AlkL） 与QSE系统，进一步优化了该系统的动态性能，提高了表达强度和均匀性，并且降低了背景表达水平。

图 1.优化了QSE系统来精细控制DDA的合成。(a)OD600和DDA产量由组成型启动子或基于QSE系统表达UcfatB。(b)基于QSE系统在不同诱导剂浓度下的表达强度。(c)对携带基于QSE系统并表达mCherry的细胞进行流式细胞术分析。

解决DDDA积累的问题

在将DDA转化为ADDA的过程中，中间体12-氧代十二烷酸可能被不可逆地氧化为DDDA。过往研究证明，在大肠杆菌中敲除具有醛还原或氧化活性的酶可以提高芳香醛的积累 （Kunjapur et al.，2014；Butler et al.，2023） 。本研究通过敲除16个醛脱氢酶和还原酶，成功减少了DDDA的积累。

图 2.解析DDDA合成的机制。（a）依次敲除7个醛脱氢酶，以及(b) 单独敲除9个醛氧化酶或还原酶对DDDA积累的影响。

利用葡萄糖和纤维二糖合成ADDA

基于对DDA细胞毒性和DDDA合成机制的深入理解，研究人员对大肠杆菌进行了改造，使其能够将葡萄糖和纤维二糖转化为ADDA，同时减少DDDA的积累以及DDA对细胞生长的负面影响。在以纤维二糖为主要碳源的条件下，菌株M997实现了509 mg/L的ADDA产量。菌株M1001在15升发酵罐中达到了1035 mg/L，从糖到ADDA的转化率为5%，且未检测出DDDA的积累。

图 3.高效从糖合成ADDA的菌株。(a) M631在表达与OsmY融合的β-葡萄糖苷酶（M997）并以纤维二糖为主要碳源。(b) M1001的发酵结果。

为了实现从葡萄糖和纤维二糖合成ADDA的一步法发酵工艺，本研究阐明了生物合成ADDA的瓶颈问题机制，发现生长中的细胞对DDA积累速率比最终DDA浓度更为敏感，解析了对DDDA积累的关键基因。研究通过改善QSE系统的性能，更严格地调控酶的转录，显著提高了DDA和ADDA的合成效率。最后，开发的一步法生产ADDA工艺实现了迄今为止从糖合成ADDA的最高产量和产率，为未来更可持续地生产ADDA、聚酰胺12及其它聚酰胺产品提供了新的思路。

中国科学院深圳先进技术研究院硕士毕业生高海鑫及研究助理方强为文章共同第一作者，正高级工程师Howard H. Chou为文章的通讯作者。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717625000254

制版人：十一

参考文献

1. Schrewe, M., Ladkau, N., Bühler, B. & Schmid, A., 2013. Direct Terminal Alkylamino-Functionalization via Multistep Biocatalysis in One Recombinant Whole-Cell Catalyst.Adv. Synth. Catal.355, 1693-1697.

2. Ladkau, N., Assmann, M., Schrewe, M., Julsing, M.K., Schmid, A. & Bühler, B., 2016. Efficient production of the Nylon 12 monomer ω-aminododecanoic acid methyl ester from renewable dodecanoic acid methyl ester with engineeredEscherichia coli. Metab. Eng.36, 1-9.

3. Ahsan, M.M., Jeon, H., Nadarajan, S.P., Chung, T., Yoo, H.-W., Kim, B.-G., Patil, M.D. & Yun, H., 2018. Biosynthesis of the Nylon 12 Monomer, ω-Aminododecanoic Acid with Novel CYP153A, AlkJ, and ω-TA Enzymes.Biotechnol. J.13, 1700562.

4. Ge, J., Wang, T., Yu, H. & Ye, L., 2025. De novo biosynthesis of nylon 12 monomer ω-aminododecanoic acid.Nature Communications16, 175.

5. Kunjapur, A.M., Tarasova, Y. & Prather, K.L.J., 2014. Synthesis and Accumulation of Aromatic Aldehydes in an Engineered Strain ofEscherichia coli. J.A.C.S.136, 11644-11654.

6. Butler, N.D., Anderson, S.R., Dickey, R.M., Nain, P. & Kunjapur, A.M., 2023. Combinatorial gene inactivation of aldehyde dehydrogenase mitigates aldehyde oxidation catalyzed by E. coli resting cells.Metab. Eng.77, 294-305.

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