《食品科学》：贵州医科大学周艳副教授等：猕猴桃皮多酚对脂多糖应激Caco-2细胞抗氧化能力的影响

肠道是机体与外界环境直接接触的最大器官，不仅在营养物质消化和吸收方面发挥作用，还能够防止病原体、膳食抗原和有害毒素等进入身体。 不当的饮食方式会 造成肠道生理功能紊乱。多酚是一种植物次级代谢物，广泛存在于水果、蔬菜和其他植物源性食品中。研究显示，多酚具有抗氧化、调节糖脂代谢、免疫调节等生理功效，其中多酚的抗氧化功能起着关键作用。

前期课题组研究发现贵州省修文县贵长猕猴桃（Actinidiaceae）富含多酚类化合物，主要含有原儿茶酸、七叶亭、没食子酸等，该多酚能够缓解高脂膳食引起的肠道通透性增加、减少氧化应激，并促进Nrf2信号通路相关蛋白mRNA的表达。

贵州医科大学公共卫生与健康学院徐瑞屿、薛沙、周艳*等采用细胞实验，以LPS刺激Caco-2为研究对象，研究猕猴桃多酚（KPP）提取物对脂多糖（LPS）诱导的细胞损伤的缓解作用，并从Keap1/Nrf2/NOQ1抗氧化信号通路探索其可能的作用机制。

01

KPP对LPS应激Caco-2细胞活力的影响

不同质量浓度（25、50、100、200、400、600、800 µg/mL）KPP与Caco-2细胞共培养24 h，如图1A所示，与正常组相比，24 h时细胞活力在质量浓度为25、50、100、200 µg/mL时无显著差异（P＞0.05），且25、50 µg/mL组的细胞存活率比100、200 µg/mL组略高；而继续提高KPP质量浓度，细胞存活率呈下降趋势，表现出对细胞活力的显著抑制作用。因此，在共培养24 h条件下选用50 µg/mL KPP作为后续处理细胞的质量浓度。用50 µg/mL KPP预处理Caco-2细胞24 h后，再经10 µg/mL LPS应激细胞24 h，观察该质量浓度KPP对LPS应激Caco-2细胞活力的影响，如图1B所示，与正常组相比，LPS组细胞活力为78.05%，差异高度显著（P＜0.001）。而经50 µg/mL KPP预处理后细胞活力为86.83%，与LPS组相比，细胞活力显著升高（P＜0.05）。

如图2所示，经KPP、LPS处理后的Caco-2细胞形态明显不同。与正常组相比，Caco-2细胞密度下降且稀疏，形态也逐渐发生改变，在显微镜40 倍视野下细胞贴壁性逐渐减弱并伴随死细胞迹象（图2C）；与LPS组相比，经50 µg/mL KPP预处理后，细胞生长密度情况未发生严重下降趋势（图2D）。综上，在不同质量浓度KPP分别处理细胞24 h时，细胞活力在质量浓度为25～200 µg/mL范围内无明显影响；经50 µg/mL KPP预处理后其细胞活力显著上升，在显微镜下观察其细胞密度尚未发生严重下降。

02

KPP对LPS应激Caco-2细胞抗氧化能力的影响

细胞内发生应激会导致ROS的过度积累，从而诱发细胞凋亡，甚至死亡。由图3A可知，与正常组相比，LPS应激细胞后其ROS水平显著升高至2.37±0.43（P＜0.001）。与LPS组相比，经50 µg/mL KPP干预24 h后，其ROS水平有所下降，显著降至1.82±0.28（P＜0.05）。由于细胞内ROS的积累引起线粒体膜电位发生改变而加重细胞的损伤，如图3B所示，与正常组相比，LPS组线粒体膜电位极显著下降至1.55±0.05（P＜0.01），而经KPP预处理后与正常组无显著差异（P＞0.05）；与LPS组相比，经KPP预处理后线粒体膜电位显著升高至1.84±0.10（P＜0.05）。因此，KPP预处理后能够有效抑制细胞内ROS水平的升高，提高线粒体膜电位的稳定性，表明KPP能缓解LPS应激造成的ROS水平升高和线粒体损伤。

由图3C～E可知，与正常组相比，LPS组SOD活性和GSH含量分别极显著降低至38.49 U/mg和18.02 µmol/mg（P＜0.01），同时MDA含量显著上升至9.65 nmol/mg（P＜0.05）；经KPP预处理后，与正常组相比，其GSH、MDA含量无显著差异（P＞0.05）。而与LPS组相比，经KPP预处理后，其SOD活力和GSH含量分别显著升高至52.57 U/mg和69.40 µmol/mg（P＜0.05），MDA含量显著下降至5.08 nmol/mg（P＜0.05）。

03

KPP对Keap1/Nrf2/NQO1抗氧化信号通路的影响

由图4可知，与正常组相比，LPS组Nrf2、NQO1、SOD1及SOD2的mRNA表达下调，其中Nrf2、NQO1和SOD1基因表达显著下调（P＜0.05），而Keap1基因表达显著上调（P＜0.05），同时，KPP预处理后，Nrf2、NQO1、SOD1、SOD2及Keap1基因表达量与正常组无显著差异（P＞0.05）；相较LPS组，经KPP预处理后，其Nrf2、NQO1基因表达显著上调（P＜0.05），Keap1基因表达显著下调（P＜0.05）。以上结果表明，KPP能够促进抗氧化酶相关基因表达水平上调。

由图5可知，与正常组相比，LPS组的Nrf2、NQO1相关抗氧化酶蛋白表达量高度显著下降（P＜0.001），而Keap1蛋白表达量高度显著上升（P＜0.001），这与real-time PCR基因表达结果一致，表明LPS可引起细胞内发生氧化应激时抗氧化系统的改变；相较LPS组，经KPP预处理后NQO1、Nrf2蛋白相对表达量分别极显著（P＜0.01）、高度显著（P＜0.001）上升，Keap1蛋白相对表达量高度显著下降（P＜0.001）。综上，KPP在LPS应激Caco-2细胞下能够调节抗氧化酶基因和蛋白的表达，从而进一步证明其能够减少肠道上皮细胞氧化应激所导致的通透性增加及损伤。

04

肠上皮细胞在维持肠道稳态中起至关重要的作用，当机体处于氧化应激状态时，肠上皮细胞易受到自由基攻击或ROS产生过多而造成损伤。多酚可作为治疗由氧化应激所引起的相关疾病的抗氧化功能因子。当细胞遭受LPS等外源性物质刺激时会产生大量的ROS，而引起细胞内氧化还原系统失衡，进一步促进细胞发生损伤。在本研究中，经LPS处理后，细胞活力和抗氧化酶蛋白表达降低，ROS生成增加，抗氧化系统发生紊乱。

在氧化应激状态下，产生的自由基主要是由电子传输链和线粒体膜电位所介导的，一旦线粒体膜电位下降，就会改变膜通透性而增加ROS水平。线粒体膜电位不仅反映线粒体功能的完整性，还对ATP合成、Ca2+转运、细胞凋亡调控及抗氧化有重要作用。Cao Shuting等发现，姜黄素处理细胞可提高细胞活力、降低细胞内ROS积累及升高线粒体膜电位，进而提高线粒体功能，从而减少细胞损伤。杨君等研究表明，白藜芦醇能够抑制ROS生成，升高线粒体膜电位，提高Nrf2蛋白表达水平。与此研究一致，本研究结果显示，KPP预处理可增加细胞活力，显著降低ROS生成水平，线粒体膜电位升高。因此，KPP能够有效保护Caco-2细胞因ROS过量积累而致肠上皮细胞损伤。

机体对自由基的清除包括酶系统和非酶系统，过低的抗氧化酶水平会导致细胞内抗氧化酶防御系统功能下降，加速细胞氧化损伤。SOD作为抗氧化酶之一，当细胞内蓄积过多的ROS时，就会激活抗氧化酶平衡氧化应激，SOD可将超氧化物转化为H2O2，再进一步转化为H2O。GSH作为一种非常重要的非酶抗氧化剂，在保护机体免受氧化损伤中起重要作用，其作为谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的底物，含量降低表明细胞受氧化应激损伤。MDA是细胞内自由基与不饱和脂肪酸发生过氧化反应产生的代谢物，其可破坏细胞膜，从而引起细胞代谢紊乱和功能障碍。本研究结果表明，在LPS应激下，KPP可提高SOD活力和GSH含量，降低MDA含量，维持细胞内ROS稳态。Lin Xinyu等研究表明，经低剂量姜黄素处理的细胞SOD活力升高且MDA含量下降。Zhuang Yu等研究发现，白藜芦醇可提高细胞内SOD与GSH-Px活力，降低MDA含量及胞内ROS水平。本研究结果与上述研究一致，KPP可增加SOD活力、GSH含量及降低MDA含量。因此，KPP在细胞受氧化应激下可增加抗氧化酶活力及非抗氧化酶含量。

Nrf2是细胞中氧化应激的感受器，也是一种转录因子，其在抗氧化系统调节中起着核心作用。当机体的抗氧化防御系统受到外界因素刺激而无法处于正常水平时，就会发生氧化应激损伤，导致抗氧化相关酶活性下降，进而导致肠道疾病的发生。Nrf2通路在保护肠道完整性方面通过预防和减轻氧化应激引起肠上皮细胞损伤，调节促炎因子和诱导抗氧化酶产生。Shen Dongbei等发现，枣皮多酚可激活Nfr2信号通路迁移至细胞核中，调节抗氧化酶，减少氧化应激和炎症。Huang Tengteng等研究发现，苹果多酚在猪空肠黏膜和IPEC-J2细胞中均可降低Keap1蛋白表达，激活Nrf2，提高抗氧化酶相关基因的表达，从而提高肠道抗氧化能力，进一步改善肠道屏障功能障碍。Keap1是Nrf2的负调节感受器，对ROS和亲电子具有较高的活性，其可参与氧化还原信号传导。正常情况下，Keap1在细胞质与Nrf2结合，导致Nrf2泛素化而降解；当细胞内ROS水平急剧上升时，Keap1/Nrf2结合不稳定，Nrf2从其中释放出来进入细胞核，导致下游抗氧化基因（如NQO1、SOD和HO-1等）表达上调。NQO1可催化醌还原成氢醌减少氧化还原循环中产生ROS，同时还能够阻止因外界环境因素刺激细胞造成胞内氧化损伤。Li Qiangqiang等研究发现，富含多酚的蜂花粉提取物处理Caco-2细胞可上调NQO1和Nrf2基因表达，改善肠黏膜屏障功能障碍。此研究与本研究结果一致，多酚能够上调NQO1、SOD1和SOD2基因的表达，同时上调Nrf2和NQO1基因表达水平较为显著，表明其可通过Nrf2信号通路减轻氧化状态的不平衡。由此可知，在细胞内抗氧化系统中，NQO1、SOD可作为Keap1/Nrf2信号通路所介导的靶基因，抗氧化基因的上调是细胞对氧化应激的保护机制，最重要的是Nrf2信号通路的调控。因此，多酚能够促进Nrf2激活，对受氧化应激的细胞平衡氧化状态起关键作用。

05

结论

综上所述，本研究可为KPP在LPS应激Caco-2细胞抗氧化影响方面提供参考依据。KPP预处理可促进抗氧化系统活性、减少ROS生成和升高线粒体膜电位，保护Caco-2细胞免受氧化应激，从而进一步减轻肠上皮细胞损伤。此外，Nrf2信号通路是KPP在细胞受氧化应激时起保护作用的通路之一。

本文《猕猴桃皮多酚对脂多糖应激Caco-2细胞抗氧化能力的影响》来源于《食品科学》2023年45卷第16期105-112页，作者：徐瑞屿，薛 沙，牛鸿艳，黄 群，周 艳*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230812-085。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：天津商业大学 梁雯菁，责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

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