《食品科学》：西南民族大学郝刚副教授等：高盐氧化体系对牦牛肉肌纤维蛋白理化特性及结构的影响

牦牛富含蛋白质、氨基酸和矿物质，多不饱和脂肪酸含量显著高于黄牛肉。在传统加工工艺中，NaCl通常作为一种调味料加入到肉制品中。牦牛肉本身含有不饱和脂肪酸、金属离子、血红素类化合物等促氧化因子，在肉类生产、储存等过程中MP容易受到活性氧自由基的攻击。蛋白氧化后可能导致蛋白质发生交联并影响其净电荷，从而影响蛋白质的结构及空间排列。

四川职业技术学院食品与生物技术学院的李璇、孙栋，西南民族大学食品科学与技术学院的郝刚*等在0.6 mol/L NaCl、不同pH值条件下蛋白质氧化对牦牛肉蛋白结构及功能性质的影响，探讨高盐环境中蛋白氧化与肌肉持水性之间的关系，旨在为降低腌肉制品水分损失提供参考。

01

蛋白氧化对牦牛肉MP羰基含量的影响

如图1所示，在pH 5.0时，羰基含量随H2O2浓度的增加而增加；当H2O2浓度为60 mmol/L时羰基含量显著高于空白对照组。羰基是蛋白发生氧化的标志性产物，随着H2O2浓度的增加，MP氧化程度加剧，但1、10、20、40 mol/L组间差异不显著，这可能是由于蛋白氧化产生的羰基可与其他蛋白分子的氨基发生席夫碱反应，使蛋白间产生共价交联，因而蛋白氧化过程中羰基在不断产生的同时也在一定程度上有所消耗。当pH 8.0时，与空白对照组相比，H2O2浓度为1 mmol/L时MP的羰基含量无显著变化，浓度为10 mmol/L时的羰基含量显著增加。

02

蛋白氧化对牦牛肉MP巯基含量的影响

总巯基包括蛋白分子表面的活性巯基和包埋于蛋白分子内部的巯基。如图2所示，总巯基含量与活性巯基含量随着氧化程度的增加而降低。pH 5.0各组的总巯基含量高于pH 8.0，表明碱处理后蛋白结构发生明显变化，暴露了更多的巯基；另外，在碱性条件下有利于半胱氨酸残基去质子，更容易被氧化成二硫键。pH 5.0时各组的活性巯基含量较pH 8.0时高，这是由于pH 8.0远离肌球蛋白的等电点，促使分子结构展开，蛋白质内部的巯基暴露出来，活性巯基含量升高。

03

蛋白氧化对牦牛肉MP双酪氨酸含量的影响

酪氨酸被氧化后产生酪氨酸自由基，其与酪氨酸残基通过共价键生成双酪氨酸，双酪氨酸含量的变化可以反映蛋白质结构的变化情况。如图3所示，随着H2O2浓度的增加，双酪氨酸含量增加，浓度为10 mmol/L时与空白对照组之间具有显著差异。酪氨酸较为敏感，易受活性氧攻击形成双酪氨酸。当pH 8.0时各组的双酪氨酸含量均低于pH 5.0。

04

MP的SDS-PAGE分析

蛋白氧化后蛋白分子之间会发生共价交联，如图4A、B所示，在非还原胶中蛋白条带颜色较浅。添加β-巯基乙醇后蛋白质的二硫键被还原，即能将分子间通过二硫键交联的蛋白分开。如图4C、D所示，这些蛋白条带在还原胶中被部分恢复；与空白对照组相比，60 mmol/L H 2 O 2 组在200 kDa左右的肌球蛋白重链（MHC）与在50 kDa左右的肌动蛋白条带变窄，说明MP氧化不仅通过二硫键产生交联，还发生非二硫键的共价交联，这与双酪氨酸含量的检测结果相对应。分子质量为200 kDa（MHC）、48 kDa（肌动蛋白）的蛋白条带在碱性环境中比在酸性环境中更加清晰。这是因为蛋白在酸性条件下更容易聚集，双酪氨酸含量在酸性pH值条件下相对更高。

05

蛋白氧化对牦牛肉MP溶解度的影响

溶解度可以表征MP聚集的程度。如图5所示，MP溶解度随着H2O2浓度的增加而降低，pH 5.0、8.0的空白对照组MP溶解度分别为89.38%和90.81%，10 mmol/L H2O2组的MP溶解度分别为83.3%和85.8%，显著低于对照组。pH 8.0各组的MP溶解度始终高于pH 5.0，这是因为pH 8.0时蛋白质所带净负电荷增加，使蛋白分子之间的静电斥力提高，蛋白质分子彼此排斥远离，导致其溶解度增加；而pH 5.0接近MP的等电点，蛋白质表面净电荷较少，彼此容易聚集，同时水合作用减少，从而降低蛋白质的溶解度。此外，MP溶解度较高是因为牦牛肉经过0.6 mol/L NaCl处理，提高了其溶解性。

06

蛋白氧化对牦牛肉MP表面疏水性的影响

pH值和离子强度可能改变蛋白质结构的构象，从而导致疏水性氨基酸残基暴露于表面，影响蛋白质的表面疏水性。如图6所示，在pH 5.0、H2O2浓度为1 mmol/L时MP表面疏水性最低，说明蛋白在pH 5.0、低浓度氧化剂条件下其分子构象变化很小。在pH 8.0、H2O2浓度不低于10 mmol/L时，MP的表面疏水性显著高于空白对照组，这是由于蛋白氧化导致蛋白构象发生改变，大量疏水基团暴露，从而使得表面疏水性增加。对比不同pH值的影响，发现在pH 8.0时各组MP具有较高的表面疏水性，由于pH 5.0时更接近蛋白等电点，蛋白质-蛋白质相互作用增加，蛋白质聚集程度加剧，阻碍了分子内部非极性氨基酸暴露于蛋白质表面，从而降低了表面疏水性。

07

蛋白氧化对牦牛肉MP内源性荧光光谱的影响

蛋白的内源荧光主要来源于芳香族氨基酸残基（色氨酸），其荧光强度被广泛用于评估肉类和肉类模型系统中色氨酸的损失。如图7所示，随着H2O2浓度的增加色氨酸荧光强度逐渐降低，这是因为一方面Fenton氧化体系产生的自由基夺取发光基团吲哚环中的氢原子，色氨酸残基最终被氧化成犬尿氨酸，荧光猝灭；另一方面，蛋白质氧化使其结构展开，位于疏水坏境的色氨酸残基暴露在亲水环境中，导致色氨酸荧光强度降低。对比不同pH值的影响，发现当pH 8.0时色氨酸荧光强度更强，这是因为pH 5.0更接近MP的等电点，更容易发生氧化聚集，聚集的蛋白会将更多的色氨酸残基包裹于分子内部更加疏水的环境中，从而引起内源荧光强度的下降。最大吸收波长（λmax）大于330 nm表明色氨酸残基处于极性环境中，蛋白质三级结构展开。pH 5.0时发射波长先发生红移再蓝移（从333.4 nm增加到334.4 nm，再降低到332.2 nm），说明此条件下随着H2O2浓度的增加蛋白质结构先展开再相互聚集，λmax增大可能是因氧化引起蛋白质结构打开，λmax减小可能是因为疏水相互作用等导致蛋白质聚集；pH 8.0时发射波长发生蓝移（从335.0 nm降低至334.0 nm），说明蛋白质发生聚集引起λmax减小。

08

蛋白氧化对牦牛肉MP二级结构的影响

二级结构能够反映蛋白质分子主链原子空间排布情况，但不包括蛋白质分子侧链的构象变化，其结构变化通常采用α-螺旋、β-折叠、β-转角含量表示。酰胺I带的峰由羰基伸缩振动引起，能直观反映蛋白质构象的变化。如图8所示，随着H 2 O 2 浓度的增加，α-螺旋含量增加，β-折叠含量减少。经比较发现，pH 5.0时β-折叠含量高于pH 8.0，α-螺旋含量则低于pH 8.0。说明在酸性条件下蛋白质二级结构发生变化，且形成蛋白质聚集体。这与上述pH 5.0时色氨酸荧光强度较低的结论一致。pH 5.0离MP等电点较近，蛋白质之间的静电斥力减弱，在酸性条件下静电作用和氢键稳定性的变化引起α-螺旋含量降低，而在酸性条件下的β-折叠含量相对于碱性条件下高。

09

蛋白氧化对牦牛肉MP肌肉水分含量及其分布的影响

如图9、10所示，MP的离心损失率和蒸煮损失率随H2O2浓度的增加而增加，H2O2浓度分别为40 mmol/L和60 mmol/L时MP的离心损失率和蒸煮损失率都显著高于空白对照组，说明肌肉随H2O2浓度的增加持水能力降低。pH 5.0时空白对照组的MP水合能力为7.59%，随着氧化程度的加深MP水合能力增加。pH 5.0条件下，当H2O2浓度为40 mmol/L时MP的水合能力（9.70%）显著高于空白对照组，说明氧化程度的加深导致肌肉从体系中吸收更多的水分；pH 8.0时肌肉的水合能力随H2O2浓度的增加变化不显著。pH 8.0腌制液中肌肉的水合能力高于pH 5.0，肌肉水合能力在其主要蛋白的等电点（pH 5.0～5.5）时最低，这是因为pH 8.0时远离MP等电点，所带负电荷增加，蛋白之间相互排斥，持水性增加；另外，当H2O2浓度在20～60 mmol/L之间，pH 8.0时肌肉的离心损失率和蒸煮损失率比pH 5.0时低。

10

蛋白氧化对牦牛肉MP横向弛豫时间T2的影响

低场核磁共振可以快速并且无损地测量高水分含量样品中的水分分布情况，从而反映肉中水分分布和蛋白质之间的相互作用。如图11所示，T21随着H2O2浓度的增加整体呈逐渐增加趋势，即不易流动水分的流动性增加，这可能是因为氧化改变了MP的结构，降低了蛋白质与水的结合强度，同时氧化还促使蛋白彼此交联，限制了肌原纤维的膨胀，降低了持水性。在pH 5.0条件下各组的T22大于pH 8.0条件。

如图12所示，P2b、P21和P22分别为结合水、不易流动水和自由水的相对含量，不易流动水含量整体随着H2O2浓度的增加而降低，而自由水的变化趋势则相反。空白对照组的不易流动水含量分别为94.93%和93.95%，H2O2浓度为1 mmol/L和60 mmol/L时MP不易流动水的含量分别为92.94%、92.16%和91.20%、89.56%。随着H2O2浓度的增加，pH 5.0时各组的MP结合水含量呈先降低后增加再降低的趋势，pH 8.0时其含量则呈整体下降的趋势。结合水是通过静电引力、氢键等作用力与蛋白质结合最紧密的水分，不会发生水分的迁移，因此结合水并不是衡量水分迁移的主要成。pH 8.0时的P21大于pH 5.0时，而P22与之相反，即pH 8.0条件下不易流动水转化自由水的比例低于pH 5.0，说明pH 8.0时肌肉的保水性更好，这与前面的离心损失率、蒸煮损失率分析结果相印证。

11

蛋白氧化对牦牛肉肌肉微观结构的影响

如图13所示，未氧化时肌纤维束的组织结构相对较为完整，间隙相对较小，随着H2O2浓度的增加，MP之间的间隙增大，肌肉微观结构遭到破坏的程度增强，这是肌纤维氧化促使骨架蛋白被降解的缘故。与pH 5.0条件相比，pH 8.0时肌纤维束较为完整且间隙较小，这说明pH值在等电点附近时，MP氧化程度更高；另外发现不同pH值条件下肌肉微观结构表面均有空隙。蛋白质氧化导致肌纤维结构发生变化，进而引起牦牛肉品质的变化，导致牦牛肉嫩度降低、变色和风味劣变等，从而引发食品变质。

12

结 论

本研究探讨了在高盐环境条件下不同pH值、H2O2浓度对牦牛肉持水性和蛋白质结构的影响。结果表明，在一定pH值条件下，随着H2O2浓度的增加，牦牛肉蛋白的羰基含量、表面疏水性显著增加（P＜0.05）；总巯基含量、活性巯基含量、蛋白质溶解度、色氨酸荧光强度、酪氨酸含量显著下降（P＜0.05）；蛋白质二级结构的α-螺旋相对含量增加，β-折叠相对含量减小；不易流动水向自由水转变；肌肉的离心损失率和蒸煮损失率增加；在一定H2O2浓度条件下，pH 5.0时MP的氧化程度更高，这是因为pH 5.0更接近MP的等电点，此时净电荷少，蛋白之间净电斥力小，蛋白与水之间相互作用力弱，MP更容易受到羟自由基的攻击；而当pH值为8.0即pH值偏离MP等电点时，蛋白质溶解度、色氨酸荧光强度、表面疏水性升高，总巯基、活性巯基、双酪氨酸含量、肌肉中的自由水含量、离心损失率和蒸煮损失率降低，扫描电镜结果也显示在pH 8.0时肌肉微观结构受损程度较小，可见同等氧化条件下，肌肉在靠近等电点时更易氧化损伤，其持水性更低，而pH 8.0时肌肉的持水能力相对较高，蛋白的净电荷增加，产生的排斥力使其肌肉结构之间的空间增加，因此能够容纳更多水分，从而提高肌肉的持水能力。

作者介绍：

李 璇，助 教，四川职业技术学院食品与生物技术学院 专任教师。食品科学专业硕士，现于四川职业技术学院食品与生物技术学院从事科研教学工作至今，研究方向为畜产品加工技术及毒素代谢生物学。

本文《高盐氧化体系对牦牛肉肌纤维蛋白理化特性及结构的影响》来源于《食品科学》2024年45卷15期49-58页。作者：李璇，孙栋，胡婷，江华明，郝刚。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20231106-032。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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