《自然通讯》：研究揭示血脑屏障SHANK3蛋白调控机制

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自闭症谱系障碍（ASD）是一种由遗传和环境因素共同作用引发的神经发育障碍性疾病。血脑屏障（BBB）作为重要的 “把关者”，将环境影响传递至脑实质，但血脑屏障在自闭症发病机制中的作用在很大程度上仍未被探明。

基于此，2025年2月6日，美国田纳西大学健康科学中心解剖学与神经生物学系Il Hwan Kim研究团队在Nature communications杂志发表了“Endothelial SHANK3 regulates tight junctions in the neonatal mouse blood-brain barrier through β-Catenin signaling”揭示了内皮细胞中的SHANK3蛋白通过β-Catenin信号通路调控新生小鼠血脑屏障中的紧密连接。

在此，自闭症风险基因SHANK3在形成血脑屏障的脑内皮细胞（BECs）中表达，并对维持血脑屏障功能至关重要的紧密连接（TJ）完整性进行调控。内皮细胞特异性Shank3敲除的新生小鼠表现出雄性特异性的血脑屏障高通透性、神经元兴奋性降低以及超声通讯受损。尽管在成年后血脑屏障通透性恢复正常，但雄性突变小鼠仍表现出神经元兴奋性降低和社交能力受损。进一步分析表明，血脑屏障高通透性是由eShank3基因敲除引发的β-Catenin失衡所致。这些研究结果揭示了一种源自自闭症风险基因Shank3的致病机制，凸显了血脑屏障中新生脑内皮细胞作为自闭症潜在治疗靶点的重要意义。

图一 一种新的Shank3变体在脑内皮细胞中表达

为探究Shank3在血脑屏障的脑内皮细胞（BECs）中的潜在作用，作者对BECs中Shank3的表达情况进行了分析。通过对小鼠和人类原代BECs、BEC细胞系以及小鼠原代神经元进行PCR分析，结果显示Shank3是在BECs中表达的唯一Shank家族成员，而神经元则表达所有三种Shank基因。经测序和PCR分析证实，在小鼠和人类原代BECs以及BEC细胞系中，脑内皮细胞的Shank3缺失外显子18（Shank3Δe18）。该分析表明，eShank3信使核糖核酸（mRNA）在脑血管系统的BECs中表达。接下来，作者分析了出生后发育过程中eShank3在不同性别中的表达模式。从出生后第5天（P5）和12周龄的雄性和雌性小鼠中纯化出原代BECs。PCR和qRT-PCR分析表明，P5 BECs中新生小鼠的eShank3 mRNA表达量显著高于成年小鼠，且雌雄之间无差异。新生儿期BECs中eShank3的大量表达表明eShank3在生命早期的血管系统和血脑屏障中可能发挥作用。由于多种Shank3异构体是通过多个基因内启动子产生的，使用qRT - PCR检测法测量了每种异构体转录本的数量，发现 “a” 和 “b” 形式是小鼠原代BECs和bEnd.3 BEC细胞系中主要的Shank3异构体。相比之下，原代神经元表达的其他异构体约占40%。重要的是，对从小鼠脑纯化的原代BECs和bEnd.3 BEC细胞系进行的免疫细胞化学分析表明，eSHANK3蛋白主要在ZO1阳性的细胞间连接区域表达，这表明eSHANK3在调节BECs的连接特性方面发挥作用，进而可能对血脑屏障的屏障功能产生影响。

图二 内皮细胞中SHANK3缺失会导致新生小鼠血脑屏障通透性、神经元功能及超声通讯出现缺陷

研究表明eSHANK3在新生儿BEC连接处有明显表达并且ASD常见于婴儿期。因此，研究人员开发了内皮特异性Shank3 a/b敲除（KO）小鼠模型（命名为eShank3-KO），以测试eSHANK3的缺失是否会影响体内BBB的通透性。通过荧光素钠注射实验，检测到P5雄性eShank3-KO小鼠的BBB旁细胞通透性显著增加，而雌性小鼠则未观察到此现象。进一步分析显示，雄性eShank3-KO新生儿的前额叶皮质、大脑皮质和小脑等多个脑区出现BBB高通透性，但雌性小鼠中无此现象。免疫组化分析表明，仅在雄性eShank3-KO幼崽的内侧前额叶皮质和体感皮质区域观察到了反应性星形胶质细胞标记物GFAP的显著增加，提示可能存在的性别特异性神经元功能障碍。在电生理学实验中，发现雄性eShank3-KO新生小鼠的动作电位频率显著降低，这表明BBB功能障碍降低了这些小鼠神经元的兴奋性。通过超声发声（USV）测试评估沟通缺陷，结果显示P5雄性eShank3-KO幼崽发出的USV呼叫数量和平均持续时间显著减少，而在雌性中没有观察到这种现象。总结来说，该研究揭示了eSHANK3在维持BBB完整性中的作用，并暗示其缺失可能导致雄性小鼠新生儿期的神经元和行为异常，特别是与ASD相关的症状。

图三 eSHANK3缺乏对成年小鼠神经元功能和社会行为的持续影响

在成年eShank3-KO小鼠中，无论雄性还是雌性其BBB通透性均恢复正常。此外，GFAP表达水平在eShank3-KO和对照组Tek-Cre成年小鼠之间没有显著差异。这些结果表明，尽管新生儿期存在BBB损伤，但随着年龄增长，通过某种补偿机制，BBB通透性得到了恢复。通过电流钳记录检测成年小鼠前额叶皮质（mPFC）中的GFP阳性锥体神经元的兴奋性。结果显示，成年雄性eShank3-KO小鼠的神经元动作电位频率显著低于对照组雄性小鼠，而这种低兴奋性并未在雌性eShank3-KO小鼠中观察到。静息膜电位在各组小鼠之间没有显著差异。这表明，尽管BBB通透性在成年后恢复正常，但新生儿期的BBB损伤导致的神经元功能障碍依然存在。

使用圆形社交竞技场（RSA）范式详细监测社会行为，实验分为两个阶段：第一阶段，测试小鼠探索带有空内笼的竞技场；第二阶段，允许小鼠与放置在内笼中的社交刺激物互动。结果显示，在社交刺激物存在时，雄性和雌性Tek-Cre对照组及雌性eShank3-KO小鼠进入S区的频率增加。然而，雄性eShank3-KO小鼠进入S区的频率不受社交刺激物存在与否的影响，表明雄性eShank3-KO小鼠对社交刺激物的兴趣降低。通过监控直接社交互动（嗅探行为），所有四组小鼠都花费更多时间嗅探社交刺激物而非空内笼。值得注意的是，雄性eShank3-KO小鼠嗅探社交刺激物的时间显著少于雄性Tek-Cre对照组，但在雌性小鼠中未观察到这种差异，表明雄性eShank3-KO小鼠的社会互动能力下降。在梳理毛发和埋珠实验中，雄性eShank3-KO小鼠表现出显著增加的重复行为。然而，在旷场和明暗箱实验中，它们的运动功能和焦虑水平正常，表明eShank3-KO对内皮细胞的影响主要限于雄性小鼠的社会和重复行为。研究表明，虽然eShank3缺乏引起的BBB损伤仅限于新生儿期，但由此导致的神经元功能障碍和社会行为缺陷在成年后仍持续存在，特别是在雄性小鼠中。这些发现揭示了eSHANK3在神经系统发育中的重要作用，并为理解ASD相关病理机制提供了新的视角。

图四 通过激活脑内皮细胞中的GSK3β恢复新生儿期血脑屏障功能可使成年小鼠的神经功能正常化

先前研究表明，GSK3β的激活可以恢复新生儿期受损的血脑屏障功能，并改善成年后的神经元功能和社会行为。作者进一步探究特异性地在脑内皮细胞中恢复正常β-Catenin信号传导是否能够改善eShank3-KO小鼠在新生儿期的BBB功能障碍。在出生时通过浅表颞静脉注射AAV-PHP.v1-CLDN5-GSK3βS9A-HA病毒使GSK3βS9A仅在eShank3-KO小鼠的BECs中表达。在P5时确认GSK3βS9A-HA在脑内皮细胞中的特异性表达。进行BBB通透性实验，结果显示在雄性eShank3-KO幼崽中观察到的荧光素渗漏明显增加的现象，通过在BECs中靶向过表达活性GSK3βS9A-HA得以恢复至正常水平。这表明GSK3βS9A对由eSHANK3缺失引起的新生儿期BBB高通透性具有挽救作用。在雄性和雌性eShank3-KO幼崽P0时通过STV注射AAV-PHP.v1-CLDN5-GSK3βS9A-HA以激活BECs中的GSK3β。

为了标记可能受到BBB影响的兴奋性神经元，通过尾静脉注射AAV-PHP.eB-CaMKIIα-EGFP，一个月后进行电流钳记录。在成年（17-19周龄）时分析前额叶皮质中GFP阳性锥体神经元的动作电位频率。结果显示，未过表达GSK3βS9A的情况下，雄性eShank3-KO小鼠的神经元动作电位频率显著低于Tek-Cre对照组。重要的是，通过在BECs中过表达GSK3βS9A，雄性eShank3-KO小鼠紊乱的动作电位频率得到了恢复，表明BECs特异性GSK3βS9A表达对雄性eShank3-KO小鼠的神经元低兴奋性具有挽救作用。在雌性小鼠中，无论是否过表达GSK3βS9A，eShank3-KO小鼠和Tek-Cre对照组之间的动作电位频率没有显著差异。此外，GSK3βS9A在BECs中的过表达并未改变雄性和雌性eShank3-KO小鼠及Tek-Cre小鼠兴奋性神经元的静息膜电位。本研究表明，通过在脑内皮细胞中特异性激活GSK3β并恢复正常β-Catenin信号传导，可以有效恢复新生儿期受损的BBB功能，并改善成年后雄性eShank3-KO小鼠的神经元功能。这些发现揭示了BECs在维持神经系统正常发育中的关键作用，并为开发针对ASD及其他相关疾病的潜在治疗策略提供了新的方向。通过早期干预恢复BBB功能，可能有助于预防或减轻长期的神经发育缺陷。

总结

本研究揭示了内皮细胞中的SHANK3通过β-Catenin信号通路调节新生儿期小鼠血脑屏障的紧密连接，维持BBB的完整性和正常功能。具体来说，eSHANK3缺乏会通过影响β-Catenin信号通路，导致紧密连接蛋白的异常表达，进而引起BBB高通透性。通过在BECs中特异性激活GSK3β，可以有效恢复BBB功能，并改善相关的神经元功能和社会行为缺陷。这一发现为理解自闭症谱系障碍等神经发育疾病的病理机制提供了新的视角，并为开发潜在的治疗策略提供了理论基础。

文章来源

https://doi.org/10.1038/s41467-025-56720-1

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