大连理工团队改造酿酒酵母合成大麻色烯酸

在现代医学领域，神经再生是备受关注的研究热点之一。大麻色原烯（CBC）作为一种非精神活性类大麻素，以其促进神经干细胞存活和分化的能力而闻名。然而，自然界中 CBC 的含量极低，其比例仅占大麻植物总产物的 0.01%-0.06%，远低于四氢大麻酚（THC）和大麻二酚（CBD）。造成这一稀缺性的原因在于，CBC 的前体物质——大麻色烯酸（CBCA）在大麻植物中的合成效率较低，同时，CBCA 的生物合成途径面临诸多限制，包括前体分子（如异戊二烯焦磷酸和 2,4-二羟基-6-戊基苯甲酸）的供应不足，以及 CBCA 合成酶（CBCAS）活性的限制。此外，大麻植物的生长周期长达 120 天，进一步增加了从植物中提取 CBC 的时间和经济成本。

大连理工大学康巍和薛闯团队针对CBCA这一目标物，利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为生产平台，成功构建了一条全新的生物合成路径，不仅显著提高了CBCA的产量，还缩短了生产周期。这一研究发表在 ACS Synthetic Biology，题为“Enhancing Cannabichromenic Acid Biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae”。

在这项研究中，CBCA 的生物合成路径经过精确重建和多层优化，使酵母菌成为了高效生产 CBCA 的微型“工厂”。CBCA 的合成过程涉及两种关键前体：异戊二烯焦磷酸（IPP）和 2,4-二羟基-6-戊基苯甲酸（OA）。研究团队通过引入和调控多个关键基因，显著提高了这两种前体的供应量，解决了 CBCA 生物合成中的瓶颈问题。

首先，为了增加 IPP 及其同分异构体 DMAPP 的供应，研究人员优化了酵母的甲戊酸（MVA）途径，这是生成 IPP 和 DMAPP 的核心代谢通路。他们通过引入 EfmvaE 和 EfmvaS（分别为乙酰乙酸-辅酶 A 硫解酶和 HMG-辅酶 A 合成酶的基因）加强了这一通路，并在 ERG20 基因的基础上引入了突变体 ERG20*（F96W/N127W 突变），减少了 GPP 向 FPP 的转化损失，从而提高了 GPP 的可用性。

除此之外，团队还引入了一条异戊烯醇利用途径（IUP），这条路径仅通过两步磷酸化反应即可高效生成 IPP 和 DMAPP，相比传统 MVA 途径需要的 17 步反应，IUP 更加简化，并且能量消耗更低。通过这一策略，酵母菌中的 IPP 和 DMAPP 水平得到了显著提升，测量数据显示其含量是未改造菌株的3.8 倍。

与此同时，OA 的合成也得到了有效提升。团队构建了一条异源途径，整合了多种微生物基因，包括 Ralstonia eutropha 的 β-酮硫解酶基因（RebktB）和 Clostridium acetobutylicum 的丁酸酯酶基因（Cacrt），并引入了来自大麻植物的聚酮合酶基因（CsTKS）和环化酶基因（CsOAC）。此外，他们通过调整关键基因（如 CsTKS、CsOAC 和 CsAAE1）的拷贝数，进一步优化了 OA 的生成量，使其产量相比初始菌株提高了 32.5%。

接下来，为实现 CBCA 的最终合成，研究人员引入了来自大麻植物的CBCA 合成酶基因（CBCAS）。然而，由于该酶的活性较低，团队通过在酵母中调整 CBCAS 的基因拷贝数并优化其定位，使其在过氧化物酶体中表现出更高的活性。他们还结合内质网辅助蛋白基因的过表达（如 ERO1 和 PDI1），解决了酶折叠和功能表达的瓶颈问题，从而大幅提升了 CBCA 的生成效率。

图|通过将 CBCA 生物合成途径工程化到酵母菌的过氧化物酶体中，并利用信号肽 SKL 将 CBCAS 定位到过氧化物酶体（来源：上述论文）

通过精心设计的代谢工程，酵母在 100 小时内完成了从葡萄糖到 CBCA 的合成，而传统大麻植物的生长周期需要约 120 天。这一突破不仅显著缩短了生产时间，还降低了生产成本，使 CBCA 的工业化生产成为可能。在发酵过程中，优化后的酵母菌株在含有葡萄糖和 2,4-二羟基-6-戊基苯甲酸的培养基中实现了31.7 μg/L 的 CBCA 产量，以及 12.0 mg 的 CBGA（大麻萜酸）产量。这些数据表明，酵母的代谢潜力在工业应用中具有巨大的开发前景。

更重要的是，这项研究还探索了将 IUP 和 CBCAS 定位到酵母的过氧化物酶体中，这一策略利用了亚细胞区室的隔离特性来减少代谢副产物的生成，并进一步提高了目标分子的产量。通过这种创新的亚细胞工程，CBCA 的生产效率进一步提升了 26.5%，为微生物合成复杂天然产物开辟了新的研究方向。

康巍和薛闯团队的研究展示了合成生物学在天然产物工业化生产中的强大潜力。通过代谢途径的精确设计、基因工程的优化以及亚细胞区室工程的创新应用，酵母菌已经从简单的发酵菌株转变为复杂分子的高效“工厂”。这种方法不仅为 CBCA 的生产提供了可持续且高效的解决方案，还为其他类大麻素和药物活性分子的微生物合成奠定了基础。未来，随着合成生物学技术的不断进步，期待更多类似突破的出现，从而推动医药、生物材料和能源领域的创新发展。

参考链接：

1.Mingming Q, Tian L, Wenqiang Z, et al. Enhancing Cannabichromenic Acid Biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae[J].ACS Synthetic Biology Article ASAP,DOI: 10.1021/acssynbio.4c00721.

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