Science丨剪接体核心蛋白介导RNA可变剪接调控

撰文丨陈哲

RNA剪接为绝大部分真核基因表达所必须，由剪接体催化的两步转酯反应完成。真核基因常含有多个内含子和外显子，外显子的选择性剪接产生了可变剪接现象，从而使得一个基因能够转录出不同的mRNA，进而编码出不同的蛋白质，执行不同的功能。早先的研究发现人类超过90%的基因具有可变剪接，其紊乱常导致遗传性疾病、神经退行性病变及肿瘤的发生【1】。虽然RNA可变剪接具有重要的生物学和病理学意义，但是调节剪接位点选择的分子机制目前仍然不太清楚。

经典观点认为，RNA的可变剪接是由于剪接调控蛋白通过与pre-mRNA中调节序列的结合，进而促进或抑制剪接体U1或U2 snRNP对剪接位点的识别所造成的【2】。剪接体是一个巨大的RNP，动态的包含一百个左右的核心蛋白质，需要依次经历E、A、B、Bact、C、C*、P、ILS等阶段，才能完成一个内含子的切除【3】。近些年的结构生物学研究揭示了剪接体催化剪接反应的众多细节，但是剪接体核心蛋白以及剪接体构象的转变在多大程度上可用于剪接位点选择的调节，仍然是一个悬而未决的问题。

近日，来自西班牙巴塞罗那科学技术研究所的Juan Valcárcel团队在Science上发表了题为Transcriptome-wide splicing network reveals specialized regulatory functions of the core spliceosome的研究工作，通过RNAi敲低了305个剪接相关蛋白的表达，进而构建了转录组范围的剪接调控网络，揭示了剪接体核心蛋白对于RNA剪接的特异性调控功能。

实际上早在2015年，Juan Valcárcel团队就通过RNAi筛选，发现剪接体核心蛋白对RNA剪接具有广泛的调控作用【4】。当时对270个剪接相关蛋白进行了RNAi敲低，然后通过剪接模式特异的引物进行PCR，最后通过高通量毛细管电泳检测RNA剪接的变化。相比于转录组测序，毛细管电泳法不能反映整个转录组的剪接变化。

在本项研究中，作者在HeLa细胞中RNAi敲低了305个剪接相关蛋白，其中包括所有的剪接体核心蛋白，然后提取成熟mRNA，通过RNA-seq检测转录组范围的剪接变化。作者检测到了超过270000个可变剪接变化，其中超过82000个剪接变化在305个敲低组中都能检测到。通过这些数据，作者发现单个剪接因子的敲低就能够导致转录组的可变剪接发生显著变化 （几百到六千多个不等） ，并且主要导致内含子保留 （RI，占45%） 和外显子跳跃 （ES，占37%） 。参与剪接位点识别的剪接因子的敲低，主要影响外显子跳跃，而参与剪接体组装和激活的剪接因子的敲低，则主要影响内含子保留。同一snRNP中不同蛋白的敲低，一般会导致相同的可变剪接模式变化，尽管各个蛋白敲低所导致的可变剪接变化仍可定性和定量区分。

Gene ontology分析发现，编码RNA剪接因子和RNA结合蛋白的基因是剪接因子敲低时，在RNA可变剪接水平上最常受到影响的基因。平均每个剪接因子的敲低会影响24个其它剪接因子的可变剪接，其中SF3B1、CWC22和XAB2的敲低会影响超过100个其它剪接因子的RNA剪接。80%的剪接因子通过可变剪接受其它剪接因子的调控，其中43%的剪接因子对其自身的可变剪接具有调控作用。剪接因子基因中50%的外显子跳跃和超过60%的可变的5’或3’剪接位点选择并不会破坏可读框。因此，剪接因子的可变剪接能够编码大量可能具有不同功能的蛋白异构体。

通过RNA剪接模式对剪接体核心蛋白进行网络分析，作者发现由剪接模式得到的网络与冷冻电镜解析的剪接体蛋白相互作用模式高度相似，并且还发现了一些结构和生化研究未发现的剪接因子网络联系。U1 snRNP包含U1A、U1-70K和U1C三个蛋白，通过可变的5’剪接位点构建的网络图中发现它们三者紧密联系。但是通过外显子跳跃这种剪接模式构建的网络图中只有U1-70K与U1C的联系。这表明U1A在可变的5’剪接位点的选择中发挥着作用，但它对外显子跳跃的决策却是可有可无的，这种分工在以前的生化及结构研究中都未被发现。

总体来说，该研究的结果展示了如何通过系统性、大规模地探究剪接体及其调控因子，并结合功能性网络重建方法，揭示剪接因子在不同生物学背景下的调控机制的案例。该数据集可用于进一步分析挖掘，例如用于探究任意剪接体蛋白或剪接因子的靶点、以及单个或特定类别可变剪接模式的调控因子的鉴定等研究中。

http://doi.org/10.1126/science.adn8105

制版人：十一

参考文献

1 Rogalska, M. E., Vivori, C. & Valcárcel, J. Regulation of pre-mRNA splicing: roles in physiology and disease, and therapeutic prospects.Nat Rev Genet24, 251-269 (2023). https://doi.org:10.1038/s41576-022-00556-8

2 Fu, X. D. & Ares, M., Jr. Context-dependent control of alternative splicing by RNA-binding proteins.Nat Rev Genet15, 689-701 (2014). https://doi.org:10.1038/nrg3778

3 Wan, R., Bai, R., Zhan, X. & Shi, Y. How Is Precursor Messenger RNA Spliced by the Spliceosome?Annu Rev Biochem89, 333-358 (2020). https://doi.org:10.1146/annurev-biochem-013118-111024

4 Papasaikas, P., Tejedor, J. R., Vigevani, L. & Valcárcel, J. Functional splicing network reveals extensive regulatory potential of the core spliceosomal machinery.Mol Cell57, 7 -22 (2015). https://doi.org:10.1016/j.molcel.2014.10.030

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