《食品科学》：青海大学韩丽娟副教授等：黄刺多糖中单糖含量与体外降血糖活性相关性分析

黄刺，学名直穗小檗（Berberis dasystachya Maxim.），是青藏高原一种药食两用的植物浆果资源。黄刺果实中富含多种生物活性物质，如小檗碱、植物甾醇、有机酸、黄酮、多糖和多酚等，一直以来备受科学界关注。黄刺多糖（BDPs）作为一种功能性植物多糖，具有抗肿瘤、降血糖及抗氧化活性等功能。 鲜见关于BDPs对高糖高脂引起的糖脂毒性（GLTy）诱导损伤的胰岛细胞活性的报道。

青海大学农牧学院的岳庆明、韩丽娟*、邓永蓉等 以青海省5 个不同产地黄刺浆 果（互助县（BDPs-I）、大通县（BDPs-II）、循化县（BDPs-IV）、湟源县（BDPs-V）及西宁市（BDPs-III）） 为研究对象，超声辅助热水浸提不同产地BDPs，首先对其理化性质及单糖组成、含量进行对比分析研究；其次，通过建立高糖高脂双诱导剂联合诱导RIN-m5F胰岛细胞GLTy模型，测定不同产地BDPs干预后细胞增殖活性、ROS、肿瘤坏死因子（TNF）-α水平；最后采用Pearson相关性分析方法，对不同产地BDPs单糖含量与降血糖活性、胰岛细胞增殖活性、ROS及TNF-α间的相关性进行分析。以期明确黄刺单糖含量与体外降血糖活性相关性，为药食同源黄刺浆果在降血糖方面开发利用及其构效关系的深入研究提供理论依据。

01

BDPs的化学组成分析

5 种BDPs中的蛋白质、还原糖、多糖及糖醛酸质量分数结果如表4所示，BDPs中化学组成存在一定的差异。其中BDPs-I中多糖质量分数显著高于其他产地多糖，为58.41%（

P

＜ 0.05 ）。 BDPs-II 中糖醛酸质量分数为 62.22 % ，显著高于其他产地多糖（

P

＜ 0.05 ），但 与 BDPs-IV 中糖醛酸质量分数差异并不显著。 BDPs-III 和 BDPs-IV 中蛋白质量分数显著低于其他多糖（

P

＜ 0.05 ），均为 0.22 % ， 5 种 BDPs 中蛋白质量分数均在 0.22 % ～ 0.40 % 之内，说明蛋白质去除较干净。 BDPs-III 中还原糖质量分数高达 0.67 % ，且与其他 BDPs 差异显著（

P

＜ 0.05 ）。由此可知，通过超声辅助热水浸提同一提取方法所得不同产地 BDPs 化学组成 均存在显著差异。

02

BDPs的单糖组成及含量分析

BDPs单糖组成离子色谱图如图2所示，结果表明各产地BDPs中共有单糖含有8 种，分别是Fuc、Rha、Gal、Glc、Xly、Man、Glc-UA、Gal-UA。其中BDPs-III和BDPs-V单糖组成中比其他3 个样品多含有一种Ara。由此可知不同产地BDPs中多糖组成存在差异。

由表5可知，BDPs-I、BDPs-II、BDPs-IV样品单糖组成一致，均由8 种单糖组成，但各单糖组分所占百分比却大相径庭。而BDPs-III和BDPs-V多糖样品由Fuc、Ara、Rha、Gal、Glc、Xly、Man、Glc-UA、Gal-UA 9 种单糖组成，各单糖组分所占百分比也不相同；通过比较其他3 种多糖样品发现，Ara仅存在于BDPs-III和BDPs-V中，且BDPs-III中Ara含量是BDPs-V的2 倍。由此可知不同产地黄刺粗多糖中单糖含量存在较大差异，推测可能与黄刺浆果产地海拔、气候条件、生长环境等不同有着密不可分的关系。

03

BDPs的分子质量分析

结合图3分子质量分析图和表6分子质量分布表可知，BDPs-III重均分子质量最小（8.673 kDa），BDPs-IV重均分子质量最大（1 322.854 kDa）。说明BDPs分子质量大小受到产地影响较大，推测可能与产地海拔、环境气候、年降雨质量等外界因素有较大关联。

04

BDPs的初级结构表征

4.1 紫外光谱分析

如图4所示，对BDPs进行紫外光谱扫描，发现BDPs均在200 nm左右波长处有强烈吸收峰，为多糖特征峰；在260 nm和280 nm左右处有较弱吸收峰，表明BDPs中可能均存在少量蛋白质及核酸，与蛋白质含量测定的结果一致。

4.2 红外光谱分析

如图5所示，在3 432 cm－1左右显现出1 个宽而强的吸收峰，此峰是由多糖分子间亦或是分子内因O—H的伸缩振动引起的。而在2 928 cm－1附近的吸收峰为烷基C—H的伸缩振动引起的。在1 746 cm－1和1 616 cm－1附近出现弱吸收峰表明多糖中存在酯羰基（—CO—）和羧基（COO—）。此外，在1 442 cm－1附近存在吸收峰，推测BDPs中含有糖醛酸，这与粗多糖中糖醛酸含量测定结果相一致。1 248 cm－1处出现的吸收峰可能是由C—O糖苷键的伸缩振动引起的，1 070 cm－1和1 024 cm－1处波峰表明黄刺粗多糖中存在吡喃糖，而779 cm－1处波峰显示的信号表明吡喃糖是以β型结构存在于BDPs中。通过红外光谱分析发现不同产地BDPs糖苷键连接方式一致，均由β-糖苷键连接且是具有吡喃糖环骨架构型的杂多糖。

4.3 扫描电子显微镜观察分析

由图6可知，BDPs结构形态呈现一定的差异性，BDPs-I以片状结构组成，表面较为平整且结构疏松，存在孔洞（图6A）。BDPs-II存在条带状结构，有细微裂缝（图6B）。BDPs-III表面整体较为光滑，但存有细微裂缝（图6C），推测由于较小的分子质量赋予了BDPs-III较为细腻光滑的外貌形状。BDPs-IV表面粗糙、凹凸不平，呈石泥堆积状（图6D），由此推测可能是由于BDPs-IV拥有较大的分子质量有关。BDPs-V表面无孔洞及裂缝，且有大小不一颗粒状存在（图6E）。扫描电子显微镜发现不同产地BDPs外貌形态差异明显，造就该现象的原因可能与BDPs分子质量大小有密不可分的关系。

4.4 刚果红试验结果

由图7可以看出，随着NaOH浓度的增大，BDPs刚果红试剂作用产生络合物的最大吸收波长均呈现连续下降的趋势，造成这种结果的原因可能是因为BDPs结构复杂，分子质量大，在水溶液中呈现无规卷曲构象，说明BDPs均不具备三螺旋结构。

05

BDPs热稳定性结果分析

如图8所示，BDPs在50～850 ℃范围间其热稳定性效果均存在较大差异。BDPs-I、BDPs-II、BDPs-IV在整体温度范围内其热解过程分为2 个阶段，其中BDP-III和BDPs-V在整体温度范围内其热解过程分为3 个阶段。BDPs-I～BDPs-V样品第一阶段质量损失率依次为7.12%、7.68%、9.26%、9.47%、9.55%，第一阶段最大质量损失速率分别出现在97.92、97.74、101.61、97.73、99.34 ℃。这一阶段损失了样品中水分，表明样品中含有不同含量的结合水以及部分吸附水。其次也印证了由于多糖相对稳定的结构进一步造就了多糖在50～200 ℃范围内保持相对稳定，同时说明该温度范围的热处理不会引起多糖的热分解，说明BDPs可应用于巴氏杀菌食品、药品等需高温处理的领域。该阶段BDPs-I质量损失最低，损失率为7.12%。说明第一阶段中BDPs-I中水分含量较低，其稳定性较好。

第二阶段BDPs-I～BDPs-V样品质量损失率依次为66.17%、68.25%、61.23%、64.37%、65.51%，该阶段最大质量损失速率分别出现在BDPs-I：252.57；BDPs-II：300.32 ℃；BDPs-III：303.81 ℃；BDPs-IV：247.59 ℃；BDPs-V：303.81 ℃。表明不同产地BDPs样品第二阶段发生热解的温度点各不相同，且各温度点相差较大，其发生热解温度点跨度范围为237.98～460.12 ℃。推测该阶段是由于高温热解过程使得BDPs样品中多糖糖苷键断裂而造成的一次较大的质量损失。

样品BDPs-III和BDPs-V第三阶段热解过程分别为587.22～845.83 ℃和543.36～845.93 ℃，该阶段样品质量损失率分别为5.26%和7.05%，最大质量损失速率出现在699.12 ℃和688.80 ℃。推测可能是样品中色素以及未去除干净的杂质在688 ℃以上高温条件下发生的热解而造成的较小的质量损失，由此说明BDPs-III和BDPs-V中含有少量杂质。

06

BDPs的体外降血糖活性

BDPs对α-葡萄糖苷酶抑制率见图9a。在实验质量浓度范围内（0.5～16 mg/mL），虽然BDPs对α-葡萄糖苷酶抑制效果显著低于阿卡波糖阳性组（

P

＜0.05），但其对α-葡萄糖苷酶仍具有较强的抑制能力，且抑制率与样品质量浓度呈正相关。BDPs-III对α-葡萄糖苷酶抑制能力较其他产地BDPs强，于16 mg/mL质量浓度下其抑制率为66.56%（

P

＜0.05）。不同产地BDPs对α-葡萄糖苷酶半抑制浓度（IC 50 ）值由小到大依次为BDPs-III（3.717 mg/mL）＜BDPs-V（14.556 mg/mL）＜BDPs-I（15.701 mg/mL）＜BDPs-II（17.155 mg/mL）＜BDPs-IV（17.697 mg/mL）。由此可见，BDP-III对于α-葡萄糖苷酶抑制能力强于其他产地BDP。

BDPs对α-淀粉酶活性抑制率测定见图9b。在实验质量浓度范围内（0.5～16 mg/mL），虽然BDPs对α-淀粉酶抑制效果显著低于阿卡波糖阳性组（

P

＜0.05），但其对α-淀粉酶表现较好的抑制能力，且抑制率与样品质量浓度之间存在一定的剂量依赖关系。在低质量浓度范围（0.5～4 mg/mL）内，BDPs-III对α-淀粉酶抑制能力显著优于其他产地样品，在高质量浓度范围（8～16 mg/mL）内，BDPs-I对α-淀粉酶抑制能力显著优于其他产地样品。在最大质量浓度条件下，BDPs-I对α-淀粉酶抑制率显著优于其余样品，其最大抑制率为67.41%（

P

＜0.05），其余4 种BDPs样品抑制率彼此并无统计学差异（

P

＞0.05）。其中不同产地BDPs对α-淀粉酶IC50值按序依次为BDPs-I（9.875 mg/mL）＜BDPs-V（10.056 mg/mL）＜BDPs-III（11.782 mg/mL）＜BDPs-IV（13.208 mg/mL）＜BDPs-II（16.264 mg/mL）。由此可见BDPs-I对于α-淀粉酶抑制效果最优。

07

不同产地BDPs对RIN-m5F胰岛细胞的保护作用

7.1 建立GLTy胰岛细胞模型

由图10可知，当诱导剂浓度不变（葡萄糖终浓度为22.5 mmol/L，棕榈酸终浓度为0.1 mmol/L），高糖高脂双诱导剂作用12 h后，细胞存活率相比NC组显著上升（

P

＜ 0.05 ）。之后随着建模时间延长，相比 NC 组细胞存活率显著降低（

P

＜ 0.01 ）。当诱导剂不变，双诱导剂作用 24 h 后，细胞存活率为（ 53.3 ± 5.01 ） % ，显著低于 NC 组（

P

＜ 0.01 ），且其值接近 50 % ，后续可采用该条件建立 GLTy 胰岛细胞模型。随着后续时间延长至 36 ～ 48 h 后发现细胞存活率显著低于 NC 组，且值远小于 50 % ，故不考虑其作为 GLTy 胰岛细胞模型建模条件。

7.2 BDPs对GLTy诱导胰岛细胞活性的影响

如图11所示，通过高糖高脂联合诱导24 h后，与NC组相比，MC组细胞存活率显著降低（

P

＜ 0.05 ），说明 GLTy 细胞模型具有一定的可靠性和稳定性。通过不同产地 BDPs 干预后，细胞存活率均显著高于 MC 组细胞（

P

＜ 0.01 ），同时经不同产地 BDPs 干预后，细胞存活率均高于 NC 组细胞（

P

＞ 0.05 ），其中 BDPs-I 组细胞存活率高达（ 105.47 ± 3.32 ） % 。由此可知不同产地 BDPs 对 GLTy 诱导的胰岛损伤细胞均具有促进胰岛细胞生长作用，其中 BDPs-I 其增殖效果最优。

7.3 BDPs对GLTy胰岛细胞ROS和TNF-α水平影响

如图12所示，高糖高脂的糖脂毒性作用于细胞后，细胞内ROS和TNF-α水平明显增加，显著高于NC组（

P

＜ 0.01 ）。经过不同产地 BDPs 组干预 24 h 后，细胞内 ROS 和 TNF-α 水平相比模型组有显著下降趋势（

P

＜ 0.05 ）。不同产地 BDPs 干预后可抑制 ROS 和 TNF-α 产生，其 ROS 抑制效果按优劣排序依次为： BDPs-V ＞ BDPs-I ＞ BDPs-IV ＞ BDPs-III ＞ BDPs-II ；其 TNF-α 抑制效果按优劣排序依次为： BDPs-I ＞ BDPs-V ＞ BDPs-II ＞ BDPs-III ＞ BDPs-IV 。通过对 ROS 和 TNF-α 抑制优劣可知，不同 BDPs 对 ROS 和 TNF-α 抑制产生效果存在较大差异，其中 BDPs-V 对 ROS 水平的抑制产生作用最强， BDPs-I 对 TNF-α 水平的抑制效果最优。由此说明高糖高脂诱导细胞使胞内 ROS 和 TNF-α 水平升高，经不同产地 BDPs 干预后可以降低 GLTy 损伤的 RIN-m5F 细胞内 ROS 和 TNF-α 水平，可抑制 GLTy 造成的细胞氧化损伤。

7.4 细胞形态学观察

如图13所示，未经处理的NC组RIN-m5F胰岛细胞整体呈聚集圆球状或梭状；经高糖高脂诱导24 h后MC组RIN-m5F胰岛细胞发生皱缩及细胞溃烂导致细胞凋亡，细胞密度逐渐降低等细胞形态变化。然而经过不同产地BDPs干预后，细胞形态逐渐恢复，细胞密度明显增加，细胞边界逐渐变圆滑。这表明不同产地BDPs对受损胰岛细胞具有促进细胞增殖、抗糖脂毒性能力。

08

相关性分析

通过化学方法测定不同产地中多糖、糖醛酸、蛋白及还原糖质量分数，结合各产地单糖组成进行相关性分析，结果如图14a所示，仅有Man与多糖、糖醛酸质量分数间呈现较强的正相关性，相关系数分别为0.52、0.54，其中多糖质量分数与Fuc、Xyl、Glc-UA等单糖存在较强的负相关性，Glc 、Gal-UA与糖醛酸质量分数呈现较强的负相关性。除Fuc、Xly与蛋白质量分数呈现较强的负相关性外，其余单糖与蛋白质量分数间相关性较弱。还原糖质量分数与单糖组成间存在较强的相关性，尤其是Fuc、Xly、Glc-UA，其与还原糖呈现较强的正相关性，相关系数均大于0.66，其余单糖与还原糖间存在较弱的相关性。

为探明BDPs中单糖质量分数与降血糖活性间的关系，将二者数据进行相关性分析研究。如图14b所示，BDPs中单糖含量与降血糖活性具有较强的相关性。其中α-葡萄糖苷酶与Glc呈现正相关性，Gal、Rha两种单糖与α-淀粉酶具有正相关关系，相关系数均在0.65以上，说明当多糖中存在Rha、Gal、Glc等单糖有助于提高其降血糖能力。除此之外，与α-葡萄糖苷酶呈现正相关性的单糖还有Gal-UA和Glc-UA，其余单糖与α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶呈现负相关性且相关性均不显著。细胞增殖活性与Man、Rha和Gal呈现正相关性，其相关系数分别为0.052（

P

＞ 0.05 ）、 0.17 （

P

＞ 0.05 ）和 0.25 （

P

＞ 0.05 ），其余单糖与细胞增殖活性均呈现负相关性，其中 Fuc 和 Xly 与细胞增殖活性呈现较强的显著负相关性，其相关系数均为－ 0.91 （

P

＜ 0.05 ）。细胞 ROS 水平与单糖 Rha 、 Gal 、 Glc 、 Gal-UA 、 Glc-UA 等单糖及糖醛酸含量呈现正相关性，其中与 Gal-UA 、 Gal 正相关性较强，相关系数均在 0.67 以上（

P

＞ 0.05 ），与其余单糖呈现负相关性尤其与 Man 间负相关较强。细胞 TNF-α 水平与 Fuc 、 Glc 、 Xly 、 Gal-UA 、 Glc-UA 等单糖及糖醛酸含量呈现正相关性，其中 Fuc 、 Xly 、 Gal-UA 具有较强的正相关性，相关系数均大于 0.68 （

P

＞ 0.05 ），与其余单糖呈现负相关性。由此说明 BDPs 降血糖活性、细胞增殖活性、 ROS 水平及 TNF-α 水平与单糖组成之间存在较强的相关性。

本研究中，首先采用化学方法对不同产地BDPs进行化学成分测定说明不同产地黄刺粗多糖中化学组成含量存在较大差异；不同产地粗多糖中单糖组成存有差异。表明各样品间化学组成和单糖组成及含量与样品产地、生长环境、果实品质等因素息息相关。

在一定实验质量浓度范围内，5 个产地黄刺粗多糖对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶均有抑制能力，但抑制率均小于阿卡波糖对照组，这可能是与BDPs为粗多糖有关，因多糖未进行纯化处理故而导致生物活性不高。黄刺粗多糖在高质量浓度下抑制率可达60%左右，说明BDPs降血糖活性优于羊肚菌胞外多糖，而黄刺粗多糖纯化后的降血糖活性有待进一步研究。多糖的降血糖活性与多糖分子质量大小和单糖组成复杂程度有着直接关系，表明多糖分子质量越小，单糖组成种类越多会使得多糖具有更高降血糖活性，这也可能是BDPs拥有较高的降血糖活性的原因之一。

胰岛细胞的GLTy是导致其功能障碍的重要原因之一，其与炎症因子，氧化应激等密切相关，因此，预防胰岛细胞凋亡及促进胰岛细胞增殖、抑制胰岛细胞氧化应激降低炎症因子水平是防治糖尿病的有效途径之一。长期暴露于高水平高糖高脂中的胰岛β细胞会发生胰岛细胞损伤，同时ROS水平及TNF-α显著升高[33]，这与本文研究结果一致。本研究中发现结合高糖高脂联合诱导可成功建立胰岛β细胞损伤模型细胞活性，与模型组相比，经BDPs干预后细胞存活率显著上升，ROS和TNF-α水平显著下降，其中BDPs-I展现了最优的增殖活性，最大程度降低了TNF-α水平。BDPs-I相比其他产地BDPs样品对受损胰岛β细胞具有更强的增殖作用，同时通过降低ROS和TNF-α水平缓解胰岛细胞凋亡，从而达到保护胰岛细胞免受GLTy侵扰的目的。

已有研究表明，植物多糖的单糖组成及含量与生物活性有着密不可分的关系，为探究BDPs中单糖含量与降血糖活性间的相关性，本研究通过Pearson相关性分析方法分析BDPs与降血糖活性间的相关性研究，发现Rha、Gal与降血糖活性相关检测指标（α-淀粉酶抑制率）呈现较强的正相关，推测多糖中含有的Rha、Gal、Gal等单糖有助于提高降血糖能力。Xly与细胞存活率呈现负相关性，其余单糖与细胞存活率相关性较弱，由此推测BDPs其较高的细胞增殖活性可能与多糖高级结构及复杂连接方式有关。Man与ROS呈现较强的负相关，说明Man可有助于抑制ROS积累，提高ROS清除效率，对GLTy损伤的细胞起到较强的保护作用。

结论

不同产地BDPs在初级结构表征、体外降血糖活性及细胞水平均存在较大的差异，其中BDPs-I具有优良的化学组成、单糖组成及含量，体现了较优的体外降血糖活性。通过促进细胞增殖、降低ROS水平和TNF-α水平达到保护胰岛细胞因受GLTy而造成的细胞凋亡，筛选出最佳产地样品为BDPs-I。BDPs中单糖含量Rha、Gal与降血糖活性（α-淀粉酶抑制率）存在较强的正相关性，Man与ROS呈现较强的负相关关系。本研究为BDPs在糖尿病治疗中的应用提供了一定依据，为BDPs在GLTy胰岛凋亡模型引起的糖尿病防治中的推广应用奠定了基础。

本文《黄刺多糖中单糖含量与体外降血糖活性相关性分析》来源于《食品科学》2024年45卷第8期122-133页，作者：岳庆明，韩丽娟，邓永蓉，马娜娜，赵玉欣。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230831-239。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：南伊；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网