天津大学李晓红团队：新型类器官-脑机接口用于脑损伤后的神经功能修复

神经回路重建对脑损伤后的修复至关重要。传统脑机接口BCI通过连接大脑与外部控制器来弥补脑丧失的功能，但在大面积空腔损伤时效果有限。大脑类器官是体外培养的三维神经组织，能够模拟神经发育与神经回路，并在宿主大脑中表现出良好的存活与轴突生长。将类器官移植到损伤区可能克服传统BCI的局限性。

近期，天津大学李晓红团队结合BCI与类器官移植，开发了类器官-脑机接口（OBCI）系统。研究评估了OBCI的长期安全性和可行性，并探讨了神经调控策略。该系统通过调控刺激促进移植物分化与成熟，增强类器官与宿主大脑的连接，展现了修复大脑功能的潜力，未来可指导神经元发育并恢复功能性神经网络。相关成果于2024年11月6日发表于《Nature Communication》期刊。

结果

OBCI模拟---体外类器官-电极复合体的创建

为模拟类器官-脑机接口（OBCI），研究人员在体外构建了类器官-电极复合体。类器官在体外培养90天后，插入双支柔性电极（图1A, B）。在第120天（D120），类器官中观察到丰富的NeuN+细胞、皮层VI层（TBR1）、V层（CTIP2）、III层（SATB2），以及大脑皮层标志物的表达。还发现星形胶质细胞（GFAP）和谷氨能神经元（VGLUT1标记）。

此外，在D120时类器官组织内形成了丰富的突触。而且从D90到D150，尖峰放电、爆发活动以及持续时间显著增加。这表明体外类器官电生理功能的逐渐成熟。

Fig1. 类器官-电极复合体刺激参数探索。A: 类器官-电极复合体示意图; B: 调节、固定和记录的时间轴; C: 尖峰发射率与刺激频率和振幅相关; D,E: 刺激改变尖峰间期分布; F,G: ES组SATB2、CTIP2和TBR1标志物表达更明显; H,I: ES组SYN+和PSD95+共标点更多，突触形成更丰富; J, K: GLUT1和MAP2染色显示ES组突触增强; L, M: GFAP和NeuN染色表明ES组胶质细胞活性更高; N,O,P,Q: ES组发射率和同步指数显著高于Ctrl组.

神经调控策略的探索---针对体外类脑器官

为了研究有效的神经调控刺激参数，研究人员在三个电极位置上测试了6个频率梯度（1,10,30,50,70,100 Hz）和4个振幅梯度（10,30,50,70 μA）。结果显示，当采用50 Hz频率和50 μA振幅的恒定电流、阴极引导、双相方波刺激时，类器官表现出更高的放电频率（图1C）。与对照组（未受刺激的类器官）相比，电刺激组（ES组）类器官的峰间间隔（ISI）显著缩短（图1D,E）。

电刺激还促进了类器官内皮层板分层结构的变化。ES组在TBR1表达上较对照组减少，CTIP2的比例增加，而SATB2的表达则无显著差异（图1G）。重要的是，ES组的突触密度更高（图1H,I），VGLUT1的表达水平较高（图1J,K），星形胶质细胞的数量较对照组有所减少（图1L,M）。电生理特性分析进一步表明，ES组的尖峰放电率、网络同步性和低频能量均高于对照组。上述结果表明，电刺激有效促进了类器官功能的成熟（图1N-R）。

OBCI的构建与长期有效性

为模拟皮层损伤，研究人员在宿主的初级感觉皮层（S1）创建了损伤空腔。研究团队将培养40天的GFP+类器官移植至宿主的S1区域(0dpt)，并在移植后第25(25dpt)天进行二次开颅手术，植入双支柔性电极以进行信号记录和电刺激，从而构建了OBCI系统（图2A-C）。

在术后第60天和第120天对电极周围进行免疫染色（图2C,D），来评估OBCI对体内组织的安全性。结果表明，电极周围未见小胶质细胞（IBA1+）或星形胶质细胞（GFAP+）聚集且大部分小胶质细胞未被激活（图2C,D）。电极周围的血管结构分布良好，神经元表现出丰富的突触素表达（图2D）。在移植物内，神经元逐渐分化（DCX）并逐步成熟（MAP2）（图2E-G）。总体而言，植入电极未对类器官或宿主大脑造成任何显著损伤。长期监测结果表明，信号活动随时间逐渐增强，表明脑类器官正在成熟，且电极持续有效（图2I,J）。

Fig2.体内构建OBCI。 A: 体内OBCI示意图; B: 移植物与小鼠大脑的明场显微照片（有/无电极）; C: 60 dpt 时 OBCI 概览; D: 60 dpt 时小鼠大脑电极插入情况; E: 120 dpt 时人类细胞核（HN，红色）和 CD31（绿色）的标记; F-H: 120 dpt 时移植物中 MAP2（F）、DCX（G）和突触（H）的免疫染色; I: 体内类器官的高通电生理轨迹; J: 电极的频谱图; K: 计算 BO、BO-ET 和 BO-ET-ES 组移植小鼠的存活率; L: 柔性电极的信噪比分析.

//**注**//

BO组：类器官植入组

BO-ET组：类器官和电极植入无调节组

BO-ET-ES组：类器官和电极植入后电刺激组

早期刺激通过OBCI促进神经发育

随后，研究人员在30 dpt和60 dpt两个关键时间点对移植物进行调控，并实施10天体内调控（图3A）。结果发现BO-ET-ES组相对于其它组表现出更好的移植物生长、分化和功能成熟。具体而言：

（1）移植物增大：60 dpt刺激后，BO-ET-ES组移植物体积显著增大（图 3B,C），且Ki67+细胞比例高于BO组和BO-ET组，表明细胞增殖增强（图3D,E）。

（2）血管浸润增强：BO-ET-ES组移植物内血管浸润更多，呈管状形态（图3F,G）。

（3）神经分化加速：与BO和BO-ET组相比，BO-ET-ES组移植物中神经祖细胞（PAX6+）减少，成熟神经元（NeuN+）增加（图3H-K）。

（4）皮质神经元亚型增加：BO-ET-ES组移植物内SATB2+和CTIP2+皮质神经元数量显著增多（图 3L-O）。

（5）突触连接性增强：BO-ET-ES组中hSYN与PSD95共定位点显著增加，表明突触连接更为成熟。

Fig3. 早期刺激通过 OBCI 促进类器官移植物分化。A: 类器官植入（0 dpt）、电极插入、1 M刺激和信号记录的时间表; B: BO、BO-ET和BO-ET-ES组小鼠大脑的类器官生长情况; C: 类器官体积定量分析, BO-ET-ES组显著增大; D: 60 dpt时，各组免疫荧光染色; E: 定量Ki67+细胞; F: 60 dpt时各组的HN和CD31免疫荧光染色; G: 血管结构（CD31），BO-ET-ES组的血管浸润更多; H-J: PAX6（神经祖细胞标记）和NeuN（成熟神经元标记）免疫染色; I-K: 定量分析PAX6+和NeuN+细胞; L-N: 120 dpt时CTIP2和SATB2的免疫荧光染色; M-O: 定量CTIP2+HN+细胞和SATB2+/GFP+细胞; P: 180 dpt时三组的hSYN和PSD95共定位的免疫荧光染色; Q: hSYN/PSD95共定位点的数量.

早期刺激通OBCI促进了移植体的功能成熟

在类器官逐步成熟后，研究人员使用OBCI评估了移植体的功能变化（图4A,B）。结果发现，在为期10天的刺激过程中，BO-ET-ES组的放电频率显著高于BO-ET组（图4C）。局部场电位（LFP）分析显示，BO-ET-ES组中频和高频带能量显著增加，而低频带能量和信息熵保持稳定（图4D）。伽马频带能量在BO-ET-ES组显著增强（图4K-M）。

重要的是，跨频率相位-幅度耦合（PAC）分析显示，BO-ET-ES组的PAC显著增强，表明移植体功能成熟度提高（图4N,O）。75dpt时，BO和BO-ET-ES组与未处理小鼠在新物体识别和运动能力测试上无显著差异，表明电刺激不会损害记忆或运动功能。

Fig4. 早期刺激可通过 OBCIs 促进器官组织的功能成熟。A: 早期刺激的时间轴; B: 行为测试图像; C: 一天内受刺激有机体电生理学变化; D: 伽马波段能量分析; E-F: 120 dpt时的高通轨迹（3秒记录）和光栅图（60秒记录）; G-J: 40-180 dpt刺激后的电生理特征; K-L: 120 dpt时功率谱密度和频谱图; M: 40-180 dpt伽马总功率百分比; N-O: Theta-Gamma相位-幅度耦合（PAC）分析; P-Q. von Frey试验结果.

晚期刺激通过OBCI改善了移植体的结构整合

类器官在60 dpt时广泛与宿主大脑连接，在此基础上研究人员评估了晚期刺激对结构整合的影响。结果发现，在120 dpt时，BO、BO-ET和BO-ET-ES组移植体均良好存活（图5C）。类器官移植体在60、120和150 dpt时逐步向宿主大脑投射，形成模糊边界的束状投射（图5D）。

此外，晚期70Hz刺激显著增加类器官向同侧宿主投射的数量和投射距离（图5E）。类器官与宿主之间形成兴奋性和抑制性突触连接（图5F-I）。同时，神经突触的成熟与密度增强，具体表现在，BO-ET-ES组移植体的神经元突触棘密度显著高于BO和BO-ET组（图5J,K）。

重要的是，类器官向宿主投射的功能性突触逐步形成，晚期刺激显著促进突触整合（图5M）。以上结果表明，晚期70 Hz刺激通过增强类器官与宿主间的神经投射、突触形成及功能整合，进一步促进了移植物与宿主大脑的连接性和功能性成熟。

Fig5. 晚期刺激通过OBCI改善了移植体的结构整合。 A: 晚期刺激（60 dpt开始）时间轴及参数; B: 移植物-宿主和宿主-移植物间的突触结构示意图; C: 不同组别小鼠在 120 dpt 时的大脑冠状切片; D:冠状切片高倍视野显示移植物的高密度GFP+神经投射; E: 120 dpt 时,投射量化分析; F-H: 120 dpt时移植物内兴奋性标记及抑制性标记的免疫染色; G-I: VGLUT1 和 GAD65/67 密度定量; J-K: 120 dpt 时的树突分支和突棘密度; L-M: 共定位点数量的量化.

晚期刺激通过OBCI改善了神经功能

最后，研究探讨了移植体与宿主大脑的电生理功能（图6A）。结果发现：在为期10天的刺激过程中，类器官的放电频率、爆发频率和爆发持续时间显著增加（图6B-D），表明移植体内突触成熟和电信号传递的提升。尖峰幅度未见显著变化（图6E），表明个体神经元的动作电位保持稳定。

重要的是，电刺激使得类器官与宿主间的连接性和耦合性增强。刺激后，类器官内部的自相关性和类器官与宿主之间的交叉相关性显著增加（图6H-J）。刺激后10天至三个月，宽带低频和伽马活动之间的相位-振幅耦合（PAC）持续增强（图6K），表明电刺激对神经网络连接的长期促进作用。von Frey机械测试发现移植体整合进宿主S1皮层功能回路，且电刺激促进了晚期行为功能恢复（图6L-N）。

Fig6. 晚期刺激通过 OBCIs 促进了器官组织与宿主之间的功能整合。A: 2 M 刺激的时间轴; B-E: 刺激后移植体不同时间段的尖峰定量; F-G: 刺激后移植体伽马频段能量与功率谱; H-I: 从第 60 天开始，每月为间隔的刺激后移植体内部及移植体-宿主之间的相关性; J: BO-ET-ES 组在 60、90、120 和 150 dpt 的相关系数分布; K: BO-ET-ES 组在 60、90、120 和 150 dpt 时 PAC 分布; L-N: 120 dpt和150 dpt时，各组在机械刺激后的频段活动变化.

此研究开发了OBCI系统，将类器官作为移植物，结合BCI提供刺激，促进类器官与宿主大脑的结构和功能整合，以此改善宿主功能。OBCI系统克服了传统设备在伤腔中的局限性。通过优化柔性电极植入策略，减少感染和损伤风险。研究发现类器官在植入25天后生长良好，适合后续电极的植入。且系统显示出良好的生物相容性，移植物在长期监测中保持功能信号复杂性的增加。

调控的策略是关键。实验表明，恒流、双相方波信号是安全有效的刺激形式。通过参数优化，证实50Hz和50μA为最佳刺激条件，可以显著的提升移植物功能成熟度。刺激还能促进细胞增殖、血管生成和神经元分化，加强移植物与宿主的整合。通过探索刺激频率的效果，发现70Hz显著增强移植物与宿主间的功能相关性。OBCI系统展示了在脑损伤修复中的潜力，未来为疾病治疗提供了新平台。

Reference：

https://www.nature.com/articles/s41467-024-53858-2

翻译整理：BrainGeek

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