Nat Cell Biol丨原肠体对称性打破的分子机制

撰文 | 存中一贯

生物系统通过打破对称性来形成跨越多尺度的空间有序结构。在胚胎中，对称性通常被外部信号打破，这些信号提供了空间位置信息的蓝图，以指导胚胎发育过程【1,2】。在胚胎发育过程中，最重要的事件之一是确定一个坐标系统来定义身体轴线。脊椎动物中，这个事件发生在原肠胚形成 （gastrulation） 时期，此时形态发生配体 （包括Wnt、BMP和Nodal） 和抑制剂的空间分布决定了特定的信号域。小鼠类原肠胚 （The mouse gastruloid） 是一种干细胞胚胎模型，它能够打破胚胎对称性并形成一个坐标系统，最显著的是前后轴 （anterior-posterior axis, A-P axis） ，对应于小鼠胚胎的后部区域【3】。在干细胞聚集后的48-72 haa （hour after aggregation） 期间孵育Wnt信号通路激活剂CHIR （CHIR-99021） 会导致gastruloids发生深刻的形态和信号改变，包括A-P轴的特化和延长，以及具有Wnt活跃信号的Brachuyury+后极的形成。但目前尚不清楚原肠体是如何产生具有Wnt活性的后极的。

最近对原肠体自组织的研究表明了多种打破胚胎对称性的候选机制。一种可能是，早期细胞聚集体的球形对称性被一种涉及信号配体和抑制剂的反应-扩散不稳定性打破，和毛囊或者指纹的形成类似【4】；另外一种机制则涉及细胞根据Wnt水平的高低重新排列到不同的区域中，类似于体节间隔的形成和乳腺器官的径向极化【5,6】。对于上述机制的区分是探究胚胎对称性打破的关键实验。

近日，来自美国普林斯顿大学的Jared E. Toettcher和Harold M. McNamara带领团队在Nature Cell Biology发表了文章Recording morphogen signals reveals mechanisms underlying gastruloid symmetry breaking，他们设计了一种合成信号记录方法，对小鼠干细胞胚胎聚集体形成中对称性打破前后不同细胞的命运变化进行了检测，并通过深入研究探明了胚胎对称性打破的关键机制。

研究人员在小鼠胚胎干细胞 （mESCs） 中构建了一个Wnt依赖的近红外荧光 （iRFP） 表达系统和组成性dsRed表达系统用以标记胚胎干细胞聚集体和Wnt表达的细胞亚群。经过检测发现，胚胎干细胞聚集体在48 haa时，Wnt活性在所有细胞中都很低，此时加入CHIR，至72 haa时，Wnt活性增强，之后不再添加CHIR，然后96 haa时，Wnt活性细胞开始变为分割开的区域化碎片，但全局的轴向极化还未形成，最后，当培养至108 haa时，gastruloids表现出Wnt活性极化区域，视为延伸的后极，这个Wnt活性后极会一直持续到144 haa。

Gastruloids培养中极化的形成有两种解释：一是反应-扩散体系，即细胞中的Wnt活性会通过反馈调节进行改变，直到形成单独极化区域；二是聚集体中Wnt活性不同的细胞会发生重排，并形成极化区域。为了更好的分析不同配体的作用，研究人员在上述细胞系中融合表达了Dox诱导表达报告系统，通过添加特定浓度的Dox，能够将dsRed转换成GFP。另外，通过改变系统中增强子的序列构建了BMP和Nodal的检测表达细胞系。

利用上述报告系统，研究人员首先通过添加dox分析不同时间点Wnt活性对gastruloids后极形成的影响。结果表明，96 haa时，Wnt活性已经能够预测原肠胚细胞的后部位置，虽然此时Wnt活性细胞还未出现明显的轴向极化，这也表明96 haa的gastruloids已经含有一个“潜藏的”A-P轴，其中不同细胞的Wnt活性高低决定了其在未来轴中的位置。另外，96 haa的胚胎干细胞聚集体中，高Wnt活性的细胞虽然还未发生极化，但会促使其向未来的后极区域移动，因此本研究更倾向于Wnt不同活性细胞向相反方向重排，形成前后轴。

对称性的打破不仅是胚胎形态的改变，同样涉及不同细胞转录表达谱的改变。研究人员通过单细胞测序分析了96 haa和120 haa胚胎干细胞聚集体中Wnt活性细胞的表达谱，发现120 haa时，Wnt活性细胞限制在延伸的后极区域，但是96 haa时，Wnt活性细胞具有不同的命运，并仅在一些细胞类群中表达，这说明96 haa时细胞和细胞间存在Wnt活性的差异，这些差异预示着未来这些细胞在胚胎中的不同命运和位置。研究人员通过酶解，使gastruloids分解为单细胞，重新培养后发现这些细胞会重新聚集，并根据Wnt活性的高低形成不同的区域，从而证实了细胞重排在gastruloid极化过程中发挥的关键作用。

对96 haa gastruloids进行单细胞测序分析，发现细胞主要分为两个类群，Wnt仅表达在其中一个类群中。两个类群的基因表达谱具有很大差异，其中一个类群表达Wnt配体，如Wnt3a、Wnt5b以及BMP和FGF配体等，而另外一个类群则表达Wnt抑制剂FrzB等基因。这同样说明，在72 haa去掉CHIR后，一些细胞中仍旧在分泌Wnt，这维持了一些细胞中Wnt的高活性。此时，添加Wnt分泌抑制剂IWP-2确实能够抑制gastruloids中Wnt的分泌，但是却不影响gastruloids细胞酶解后的重新聚集效应，说明96 haa后gastruloids自身分泌的Wnt并不影响其轴向极化的形成。

之后，研究人员还发现胞外粘附分子在胚胎干细胞的重排中发挥了关键作用，而先于Wnt发挥作用的Nodal-BMP活性改变是胚胎对称性打破的关键因素，它们在胚胎干细胞的轴向极化中起到了重要作用。

总之，本研究通过小鼠原肠体胚胎自组织模型深入探究了胚胎发育过程中对称性打破的具体机制，探明了细胞通过重排实现轴向极化的发育过程，为理解胚胎发育提供了详细的研究基础。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41556-024-01521-9

制版人：十一

参考文献

1. Bardot, E. S. & Hadjantonakis, A.-K. Mouse gastrulation: coordination of tissue patterning, specification and diversification of cell fate.Mech. Dev.163, 103617 (2020).

2. Gregor, T., Wieschaus, E. F., McGregor, A. P., Bialek, W. & Tank, D. W. Stability and nuclear dynamics of the bicoid morphogen gradient.Cell130, 141–152 (2007).

3. Turner, D. A. et al. Anteroposterior polarity and elongation in the absence of extra-embryonic tissues and of spatially localized signalling in gastruloids: mammalian embryonic organoids.Development144, 3894–3906 (2017).

4. Ishihara, K. & Tanaka, E. M. Spontaneous symmetry breaking and pattern formation of organoids.Curr. Opin. Syst. Biol.11, 123–128 (2018).

5. Hashmi, A. et al. Cell-state transitions and collective cell movement generate an endoderm-like region in gastruloids.eLife11, e59371 (2022).

6. Miao, Y. et al. Reconstruction and deconstruction of human somitogenesis in vitro.Nature614, 500–508 (2023).

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