动物模型与评估丨啮齿动物喉返神经损伤模型

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迷走神经在上呼吸道分支为喉上神经（superior laryngeal nerve，SLN）和喉返神经（recurrent laryngeal nerve，RLN），喉返神经损伤是临床上较为常见的问题，会导致声音嘶哑、吞咽困难等诸多症状。建立鼠喉返神经损伤模型可以更好地理解喉返神经损伤的病理生理机制，为开发新的治疗方法提供理论依据。

Fig1 喉返神经示意图

常用的建立方法

机械损伤法

是一种比较直接的方法，在手术显微镜下，通过精细的器械（如显微镊子、显微剪刀等）对小鼠的喉返神经进行夹闭或切断操作。夹闭操作可以模拟神经受压的情况，切断操作则是完全性损伤模型。例如，使用特制的显微血管夹夹闭喉返神经一定时间后松开，造成神经短暂缺血再灌注损伤，观察神经功能恢复情况以及相应肌肉的变化。

选用健康清洁级实验用SD雄性大鼠，年龄8～9个月，体重220-25-g。所有实验用鼠内镜系统检查其喉部大体形态及声带运动情况均正常，叫声响亮无异常。腹腔麻醉大鼠成功后，固定大鼠，于左侧气管食管沟分离喉返神经。以两只单极电极刺激喉返神经，在甲杓肌记录相应动作电位，从而证实确为喉返神经。喉返神经完全损伤组（横断伤）：于第七气管环水平眼科剪剪断5mm，确定同侧甲杓肌诱发电位消失后，断端局部筋膜包埋，逐层缝合颈前肌肉、皮下组织及皮肤。喉返神经不完全损伤组（钳夹伤）：模拟临床喉返神经损伤方式，分离SD大鼠左侧喉返神经，以小蚊式钳一个扣钳夹喉返神经10min，逐层缝合颈前肌肉、皮下组织及皮肤。使用微钩将喉返神经垂直放置在光滑的止血钳上，止血钳关闭至第二锁定位置，持续30秒。对照组手术分离暴露SD大鼠左侧喉返神经后，逐层缝合颈前肌肉、皮下组织及皮肤。

Fig2 将RLN从甲状腺下动脉（黑色星号）分离出来，为手术切断做准备

化学损伤法

利用某些化学物质来损伤喉返神经。比如，将一定浓度的酒精（如 95% 乙醇）注射到喉返神经周围，乙醇可以使神经纤维发生脱水、变性等改变。或者使用神经毒性药物，如长春新碱，它可以干扰神经细胞的微管功能，抑制神经的正常代谢。但这种方法在控制损伤程度上可能相对较难，因为化学物质的扩散范围和作用强度可能受到多种因素的影响。

电损伤法

通过电极施加电流来损伤喉返神经，可以使用双极电极，将电极尖端放置在喉返神经附近，给予适当强度（如1 - 3毫安）和时间（如5 - 10秒）的电刺激，电流会导致神经细胞膜的破坏，引起神经传导功能障碍。这种方法的优点是可以比较精确地控制损伤程度，通过调整电流强度和刺激时间来模拟不同程度的损伤。

模型评估

观察小鼠的发声情况，正常小鼠发声清脆响亮，喉返神经损伤后，小鼠的发声可能会变得嘶哑、微弱甚至失声。可以通过专业的音频分析软件来量化小鼠发声的频率、强度等参数的变化。同时，还可以观察小鼠的吞咽行为。喉返神经损伤可能会导致吞咽困难，小鼠在进食或饮水时可能会出现呛咳、吞咽延迟等现象。

电生理评估

利用电生理仪器来检测喉返神经的传导功能。例如，将电极插入喉返神经的近心端和远心端，给予一定强度的电刺激，记录远心端的动作电位。损伤后的喉返神经动作电位的幅度可能会降低、传导速度可能会减慢，通过这些参数可以准确地评估神经功能的损伤程度和恢复情况。

造模成功后6h、12h、1d、3d、5d、1周、2周、3周及４周观察以下项目：

①喉运动情况：分别对完全损伤组、不完全损伤组以及对照组大鼠在0°鼻内镜下观察声带运动情况。通过喉镜检查声带的活动情况，以评估即时效应。

②喉肌电图检查：主要观察指标：ａ．常规肌电特征，包括自发电位特征，平静呼吸时观察喉肌单个运动单位特征，刺激深呼吸时观察募集电位；ｂ．肌诱发电位特征。

Fig3 小鼠内镜系统和喉镜检查过程

定制的小鼠内镜系统 (a)侧视图：展示了用于小鼠喉镜检查的定制内镜系统的侧视图。该系统包括显微操作器、耳杆固定装置、内镜显示器等组件。组件标签：图中标记了各个关键组件，以便于识别和操作。

小鼠喉镜检查过程 (b)麻醉和体位：小鼠在背侧卧位下进行全身麻醉，头部通过耳杆轻轻固定，确保其稳定不动。内镜插入：使用显微操作器精确引导带有定制喉镜的唾液腺镜的口内插入、温和推进和精确定位，以清晰地观察喉部结构。

代表性内镜图像 (c)最大声带外展：显示在自发呼吸时小鼠喉部的最大声带外展状态。该图像从30帧/秒的视频中截取，代表手术前的基线状态。

可见的喉部结构：

双侧声带（VF）：用黑色星号标记，显示声带的位置和形态。

会厌：位于声带上方，起到保护气道的作用。

杓会厌皱襞（AEF）：连接会厌和杓状软骨，形成喉部的一部分。

梨状窝（PS）：位于喉部两侧，是喉部的重要解剖结构。

与人类喉部的区别：

背侧联合：小鼠的声带在背侧联合处保持靠近中线（黄色星号），与人类不同。

腹侧联合：小鼠的腹侧联合始终被会厌遮挡，而人类的腹侧联合通常是可见的。

文献引用：

• Prescott SL, Umans BD, Williams EK, Brust RD, Liberles SD. An Airway Protection Program Revealed by Sweeping Genetic Control of Vagal Afferents. Cell. 2020 Apr 30;181(3):574-589.e14.

• 白玉,徐文,胡蓉,等.喉返神经损伤后神经肌肉变化及再生特点研究[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2017,31(12):932-936.

• Xu W, Han D, Hou L, Hu R, Wang L. Clinical and electrophysiological characteristics of larynx in myasthenia gravis. Ann Otol Rhinol Laryngol. 2009 Sep;118(9):656-61.

• Mok A, Allen J, Haney MM, Deninger I, Ballenger B, Caywood V, Osman KL, Zitsch B, Hopewell BL, Thiessen A, Szewczyk M, Ohlhausen D, Newberry CI, Leary E, Lever TE. A Surgical Mouse Model for Advancing Laryngeal Nerve Regeneration Strategies. Dysphagia. 2020 Jun;35(3):419-437.

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