Phytomedicine | CETSA和TPP策略用于天然产物的靶点鉴定和药物发现 (一)

2023年5月20日，江苏大学药学院联合澳门大学中医药研究所在Phytomedicine在线发表了题为“CETSA and thermal proteome profiling strategies for target identification and drug discovery of natural products”的文章。综述了CETSA及TPP在天然产物（NPs）靶点鉴定中的应用。

CETSA经过近十年的升级和演变，主要发展为三种形式:经典的蛋白质印迹(WB)-CETSA用于靶点验证，热蛋白质组分析(TPP，又称MS-CETSA)用于全蛋白质组的无偏性靶点鉴定，高通量(HT)-CETSA用于药物靶点发现和导联优化。重点讨论了多种TPP方法在生物活性纳米颗粒靶点发现中的应用可能性，包括TPP-温度范围(TPP- tr)、TPP-化合物浓度范围(TPP- ccr)、二维TPP (2D-TPP)、细胞表面TPP (CS-TPP)、简化TPP (STPP)、基于热稳定性位移的2D凝胶电泳荧光差异(TS-FITGE)和沉淀物支持的TPP (PSTPP)。此外，还讨论了CETSA策略在NP研究中的主要优势、局限性和未来展望。

1. CETSA的基本原理及其衍生策略

一般来说，蛋白质随着加热温度的升高而展开、变性和沉淀。然而，配体与靶蛋白结合可以提高蛋白的热稳定性，使与配体结合的蛋白在相同温度下比天然蛋白更不容易发生变性和聚集。这一现象可以用配体-蛋白质复合物具有比天然蛋白质更低的能态这一事实来解释，因此需要克服更高的能垒才能实现去折叠。基于以上的生物物理学原理，热位移分析(tsa)在过去的20年里已经被建立并应用于药物-蛋白相互作用的表征、药物发现和结构生物学。然而，传统的tsa最大的局限性是它们只能用于纯化蛋白的实验。2013年，Pär Nordlund及其同事将tsa扩展到细胞格式，首先开发了一种概念上相似的技术，命名为CETSA，该技术实现了在生理学相关的细胞环境中对药物-靶点结合的直接评估。在最初的报告中，药物和一组临床癌症靶点之间的靶点结合是在哺乳动物完整细胞，细胞裂解物和组织中确定的。在接下来的十年中，CETSA和变体方法被用于从可溶性蛋白到膜蛋白的蛋白质研究，并已被证明广泛适用于多种模式生物，包括哺乳动物、细菌、人类寄生虫、植物、病毒、斑马鱼、苍蝇和线虫。

简单地说，CETSA的工作流程包括以下步骤:(1)样品制备，包括活细胞、细胞裂解物或组织样品;(2)药物治疗时间;(3)短时梯度热激:随着温度的升高，与药物结合的蛋白相对稳定，而未结合的蛋白迅速变性沉淀;(4)细胞裂解(可选步骤):完整的细胞和组织需要裂解;(5)通过高速离心或过滤从可溶性蛋白部分中去除细胞碎片和聚集体;和(6)使用定量技术，如蛋白质印迹(WB)和基于ms的蛋白质组学检测剩余的热稳定或不稳定的蛋白质(图1)。因此，建立了目标蛋白的热熔解曲线(或更准确地说，温度诱导的聚集曲线)，其中蛋白质熔点(Tm)被定义为熔解曲线值为0.5的温度。熔解曲线的变化和Tm值的变化(ΔTm)间接反映了蛋白质热稳定性的变化，从而跟踪细胞内药物-靶点的结合。然而，需要注意的是，熔解曲线的偏移只能确定在测量的药物浓度下是否存在药物-靶点相互作用，而不能确定药物的靶点占用程度(即“效力”)。药物的相对效力可以通过另一个等温剂量-反应(ITDR)-CETSA实验来确定，在该实验中，在保持加热温度恒定的情况下，应用一系列药物浓度来评估药物的剂量依赖性热稳定性。因此，ITDR-CETSA可以通过比较其半最大有效剂量(EC50)来对一系列化合物与相同靶蛋白的结合能力进行排序(图1)。值得注意的是，实验温度点对ITDR-CETSA的成功至关重要，通常是大多数感兴趣的未配体蛋白在蛋白质熔解曲线中变性和沉淀的温度，以确保清晰地观察到药物结合(通常靠近Tm)引起的蛋白质热稳定性变化。但是，应避免温度过高，因为这会导致药物失去热稳定敏感性或破坏细胞膜完整性，这可能会导致较弱的结合物的遗漏或错误的结果。

CETSA操作简单，兼容性高，可以与多个读出平台相结合，从而产生多种CETSA变体策略。在过去的十年中，CETSA及其衍生方法蓬勃发展，并成为药物发现和开发的所有阶段的强大工具。根据加热后剩余可溶性蛋白的定量方法，CETSA及其衍生策略可分为三种格式。(1)经典WB-CETSA，采用基于抗体的Western blot分析方法检测目标蛋白的热稳定性变化。然而，该方法仅能实现低通量输出，并且受到WB所需的高度特异性抗体的限制。这种经典的CETSA格式通常用于验证候选药物和细胞环境中其他方法确定的潜在靶点之间的直接相互作用。(2)热蛋白质组分析(TPP，又称MS-CETSA)，利用基于ms的定量蛋白质组学或双向差异凝胶电泳(2D DIGE)对蛋白质进行鉴定和定量，从而获得生理相关环境下全蛋白质组的蛋白质稳定性图谱。TPP和改良的TPP方法对于基于表型的药物发现衍生的生物活性化合物的靶点鉴定非常理想。(3)高通量(HT)-CETSA，将CETSA与AlphaScreen、报告基因发光、免疫荧光等均质检测平台相结合，将其转化为HT格式。这种格式可以通过高通量测量化合物文库的靶点接触来实现原位大规模靶向药物发现。在接下来的章节中，我们重点讨论了这三种不同形式的CETSA在纳米粒药物先导物发现、靶点鉴定和靶点验证中的应用，并详细讨论了CETSA策略在纳米粒研究中的优势、局限性和未来展望，期望对CETSA辅助纳米粒药物开发提供重要的指导。

图1 WB-CETSA和ITDR-CETSA的生物活性纳米粒子靶点验证工作流程。将活细胞、细胞裂解物或组织样本分装，用纳米粒子或溶剂进行指定时间的处理，然后在不同温度范围内进行短时热挑战。之后，将细胞样本裂解(对于活细胞)，通过离心或过滤获得可溶性蛋白部分。可溶性蛋白使用目标特异性抗体进行SDS - PAGE凝胶电泳进行半定量蛋白质印迹。计算np处理或溶剂处理样品中目标蛋白的熔解曲线和Tm值。熔解曲线的偏移和Tm值的变化(ΔTm)可以反映NP结合后蛋白质热稳定性的变化(稳定或不稳定)，从而跟踪细胞内的靶点结合。对于ITDR- cetsa，样品被分配，用一系列的NP浓度或溶剂处理，然后在固定的ITDR温度下进行热挑战。随后通过Western blot分析计算纳米粒子的ITDR曲线和EC50值，从而评估纳米粒子的相对效力。

经典WB-CETSA策略用于生物活性天然产物的靶点验证

目前，许多间接和直接的策略已被用于揭示与其表型相关的天然产物的靶点。必须指出，通过间接或直接策略获得的蛋白质靶信息是“潜在的”或“假定的”;因此，后续靶点验证非常必要，以排除假阳性靶点，确认真靶点。生化检测一直是靶点验证的常用方法。然而，这些检测很容易受到纯化蛋白的限制。此外，当转移到更复杂的细胞环境时，生化检测证实的靶点结合可能减弱或丢失。最近，WB-CETSA策略在天然产物的靶点验证中受到越来越多的关注，它可以在细胞裂解物、完整细胞甚至组织中提供药物-靶点相互作用的直接证据。通过与Western blot分析相结合，WB-CETSA平台通过提供可视化的蛋白条带结果，为一个或几个目标蛋白提供了可靠的确认(图1)。由于对实验设备要求相对较低，在实验室中非常容易建立。该平台只需要目标蛋白的特异性抗体，而不需要纯化蛋白，因此极大地扩展了可验证靶点的范围，尤其是那些纯化蛋白难以获得或昂贵的靶点。由于不需要对天然产物进行修饰，也不需要示踪剂来显示靶点的结合，WB-CETSA理论上可以检测所有结构类型的天然产物与靶点的结合，只要有高质量的抗体。

WB-CETSA和ITDR-CETSA进行靶点验证

WB-CETSA作为近年来天然产物靶标验证的有力工具，适应多种结构类型的天然产物，包括萜类、黄酮类、异黄酮、生物碱和酚类。这些天然产物表现出广泛的药理活性，包括抗癌、抗炎、神经保护、抗骨质疏松、抗类风湿关节炎(RA)和抑制急性肝损伤。通常，WB-CETSA通常在疾病相关的细胞系统中进行，以连接已验证的靶点和观察到的天然产物引起的表型。目前，WB-CETSA验证是NPs靶点鉴定后的重要后续步骤，通过多种方法，包括基于靶点的药物发现(TBDD)、化学蛋白质组学、基于结构的虚拟筛选(SBVS)、基于靶点的虚拟筛选(TBVS)和间接策略。随后，WB-CETSA提供了这些具有生物活性的天然产物直接与它们的蛋白靶标结合的确凿证据。综上所述，WB-CETSA具有普遍的适用性，并已成为原位验证细胞环境中np -靶点相互作用的重要平台。

WB-CETSA和ITDR-CETSA实施的关键考虑因素

药物处理、加热温度、加热时间、细胞裂解和离心步骤的关键考虑因素是确保WB-CETSA在生物活性纳米粒子靶点验证中的成功所必需的。(1)药物处理:完整细胞中天然产物的处理浓度与活性测定中使用的浓度基本一致，而WB-CETSA在细胞裂解液中进行时(通常是活细胞中测试浓度的10倍)，需要更高的天然产物浓度才能获得良好的结果。这是因为药物会高效地转运到活细胞中，导致NPs在完整细胞中大量积累。与在细胞裂解液中(一般≤1 h)相比，在完整细胞中(一般≥2 h)需要更长的药物处理时间来实现NPs的跨细胞膜饱和转运。然而，在活细胞中过量的药物处理时间需要仔细考虑，因为这可能导致CETSA结果不能反映目标蛋白的热稳定，而是由初始药物-靶点结合间接诱导的下游效应。(2)加热温度:无论在活细胞还是细胞裂解物的CETSA实验中，加热都被认为是关键问题。WB-CETSA的加热温度范围是可变的，并取决于目标蛋白的热性质。因此，可能需要预实验来确定热变性的合理温度范围。(3)加热时间:大多数WB-CETSA实验均采用3 min或5 min加热，即短时间热脉冲即可使目标蛋白变性和沉淀。然而，对于大多数可溶性蛋白来说，不建议采用细胞过热的方法，因为这会改变细胞系统的平衡，并对细胞通透性产生负面影响，从而允许在生理温度下不通过膜的天然产物进入细胞，从而导致错误的观察结果。(4)细胞裂解:WB-CETSA除原报道中的反复冻融循环裂解外，还可与多种细胞裂解缓冲液裂解、匀浆裂解等其他裂解方法相兼容。然而，必须确保去垢剂裂解缓冲液不会干扰在变性蛋白背景下对剩余稳定蛋白的选择性和准确检测。应避免使用洗涤剂SDS，因为它会导致热蛋白沉淀的溶解，而推荐使用0.4% NP-40裂解缓冲液来测定NPs和细胞膜蛋白之间的靶点结合，因为它足以溶解许多膜蛋白，而不影响药物与蛋白的亲和力。(5)离心:在原报告中，细胞裂解后剩余的可溶性蛋白部分采用20000 × g离心20 min的方法去除细胞碎片和沉淀。然而，有一些报道称，在低于这一标准的离心条件下，成功实现了WB-CETSA。13000 rpm的值持续20分钟以上应该是保证完全去除沉淀的最低阈值。过滤被认为是分离可溶性和沉淀蛋白的另一种可行方法。最后，建议WB-CETSA至少重复3次才能获得有统计学意义的结果。

在实施WB-CETSA后，鼓励ITDR-CETSA在接近Tm的特定温度下评估天然产物的剂量依赖性靶结合，这不仅进一步证实了WB-CETSA的结果，而且通过测定EC50值提供了纳米粒子的目标占有率。建议在进行ITDR- cetsa时，同时建立37℃的ITDR曲线作为阴性对照。此外，建议在完整细胞和细胞裂解物中进行WB-CETSA，以更稳健地验证天然产物的靶向结合。虽然报道较少，但WB-CETSA同样能够回答药物或天然产物是否在组织水平真正作用于它们假定的靶点的问题。组织水平的WB-CETSA检测不仅提供了体内药物靶点结合的证据，而且还提供了药物是否到达预期组织及其在不同组织中的进一步分布的有用信息;因此，在未来的NP研究中需要给予更多的关注。需要指出的是，仅通过CETSA验证不足以提供令人信服的目标接触证据。通常，目标验证通过CETSA与其他验证方法相结合来实现，以提供药物-靶点相互作用的多层次证据，包括无细胞分析、基于细胞的分析、计算机模拟方法。此外，CETSA检测也被广泛用于合成小分子和临床前/临床药物的细胞靶点验证和MoA阐明，但这超出了本综述的范围。

2. 热蛋白质组分析(TPP)策略用于生物活性天然产物的靶点鉴定

目前，WB-CETSA被认为是一种简单而可靠的评估天然产物与细胞靶点结合的策略。然而，该策略是基于已知的目标蛋白信息和可用的抗体建立的，主要集中于对单个预定义蛋白的低通量测定。WB-CETSA不能通过获得细胞蛋白质组水平的全局数据来无偏倚地发现天然产物的非预期靶点。近几十年来，基于质谱技术的定量蛋白质组学发展迅速，极大地促进了我们对细胞蛋白质组的全面了解。2014年，Savitski et al.开发了一种升级版的CETSA方法，命名为TPP(或MS-CETSA)，该方法通过引入多重定量MS检测平台而不是采用蛋白质印迹法，首次实现了在细胞环境中全蛋白质组范围内对蛋白质(超过7000种蛋白质)的热稳定性的同时测量。此后出现了一些改进的TPP方法，包括二维TPP (2D-TPP)、细胞表面TPP (CS-TPP)、简化TPP (STPP)、基于热稳定性位移的双向凝胶电泳荧光差异(TS-FITGE)和沉淀支持的TPP (PSTPP)。虽然这些TPP平台的实施极大地促进了许多小分子药物的靶点识别、脱靶发现、多药理学解释和耐药研究，但其在天然产物中的应用仍略显不足。在此，我们总结并讨论了不同TPP方法在生物活性天然产物靶点发现中的可能性，以期为未来使用TPP策略研究MoAs和天然产物的不良影响提供有意义的指导。

tpp -温度范围(TPP-TR)和tpp -化合物浓度范围(TPP-CCR)用于天然产物的目标识别

TPP一般包括两种类型的实验:一种是TPP- tr实验，类似于WB-CETSA，即在固定的药物浓度下检测温度依赖性的蛋白质组热稳定性;另一个是TPP-CCR实验，类似于ITDR-CETSA，即在固定温度点检测药物浓度依赖性的全蛋白质组热稳定性(图2)。在完整细胞的典型tp - tr方案中，首先将细胞与饱和浓度的药物或溶剂对照孵育一段时间。然后将处理后的细胞分成10份，每份在不同的温度点加热，诱导蛋白质变性和聚集，然后进行细胞裂解并去除蛋白质沉淀。将每个温度下剩余的可溶性蛋白样品进行胰蛋白酶处理并使用多重同位素串联质量标签(TMT10)进行标记。然后，将10个温度处理的样品混合，引入LC-MS /MS进行大规模蛋白鉴定和定量。在药物或溶媒处理组中，通过使用TPP的可用R包来拟合和计算蛋白质熔解曲线和Tm值(它们是决定蛋白质是否为靶标的“法官”)。TPP-CCR实验可作为TPP-TR实验确定的药物靶点的理想验证方法。在TPP-CCR中，随着药物或溶媒浓度的增加，细胞被处理，并计算在预定温度下蛋白质的剂量-反应曲线和相应的pEC50值，而不是熔解曲线和Tm。尽管蛋白质在TPP-TR的药物治疗条件下显示出显著改善的热稳定性，但如果它在TPP-CCR实验中没有表现出药物剂量依赖性行为，则很可能是假阳性结果。需要注意的是，药物结合并不总是增加靶蛋白的热稳定性，在TPP实验中偶尔观察到药物诱导的蛋白不稳定。WB-CETSA中的20000 × g离心被TPP中的10万× g超速离心步骤替换为20分钟，以最小化后续MS检测中的信噪比。此外，强烈建议对TPP至少进行两次生物学重复，以消除假阳性结果。

TPP除了识别药物的直接靶点外，还可以识别间接靶点(即初始药物-靶点结合引起的下游效应)。在细胞裂解物中进行的TPP被认为可以通过破坏信号蛋白复合物和稀释裂解物系统中的细胞内容物来揭示直接的药物靶点。然而，在活细胞中，蛋白质热稳定性的变化不仅归因于药物结合，也可能归因于药物激活的下游事件，如翻译后修饰(PTMs)或生理配体(代谢物、核酸或其他蛋白质)的结合。通过比较从细胞裂解物和完整细胞中鉴定出的热稳定性改变的蛋白质，可以区分直接靶点和间接靶点。或者，缩短药物治疗时间是一种建议的方法，可以最大限度地提高靶点占用率，同时最大限度地减少药物在活细胞中的下游效应。

图2 生物活性天然产物靶标鉴定的TPP和2D-TPP工作流程。(A) TPP-TR工作流程:首先将细胞样本分成10份，用天然产物或溶剂处理指定时间。在不同温度下进行短时间热应激后，用TMT10标记获得的可溶性蛋白质组，然后进行多重质谱蛋白质组学分析。拟合了全蛋白质组熔解曲线，计算出的ΔTm可以对整个蛋白质组中潜在的目标蛋白(稳定或不稳定)进行排序。(B) TPP-CCR工作流程:细胞样本被分配，用一系列NP浓度或溶剂处理，然后在固定的ITDR温度下进行热挑战。利用tmt - MS蛋白质组学技术计算全蛋白质组ITDR曲线和EC50值，筛选有前景的靶蛋白。(C)细胞样品等分用一系列NP浓度(通常5个浓度)处理，同时每个浓度在各种温度(通常10个温度)下引入热挑战。基于tmt的MS蛋白质组学分析后，2D- tpp结果可以显示在由NP浓度轴和温度轴组成的2D热图中，这为目标蛋白提供了热稳定性和药物亲和力信息。

二维TPP (2D-TPP)用于天然产物的靶点识别

2D-TPP被设计为TPP-TR和TPP-CCR策略的组合，其中细胞或细胞裂解物用一系列浓度的药物处理，每种浓度的药物在不同的温度下进行热激发。因此，2D-TPP能够同时测量温度依赖性蛋白质的热稳定性和浓度依赖性药物亲和力。2D-TPP结果可以显示在由药物浓度轴和温度轴组成的2D热图中，而不是TPP中每个蛋白的一维熔解曲线，这导致对靶标结合的评估不仅限于熔解曲线中的Tm位移，而且还限于每个选定温度点的药物的目标占用效价(pEC50) (图2)。因此，与tp - tr或tp - ccr相比，2D-TPP可以被认为是一种更敏感、更精确的药物靶点鉴定方法。在2D-TPP方案中，在同一MS实验中分析一系列浓度范围内的药物处理和未处理样品，从而获得更准确的蛋白质定量和更少的假阳性结果。此外，2D-TPP可以提供额外的信息，即蛋白质丰度在所有温度点(尤其是生理温度37℃)的变化可能是由于药物影响的蛋白表达而不是热稳定性，这一特征可能有助于发现导致靶点降解的蛋白水解靶向嵌合体(proteolysis targeting chimera, PROTAC)药物。然而，这种2D格式的TPP尚未被报道用于天然产物的靶点发现。

细胞表面TPP (CS-TPP)用于纳米粒子的靶点鉴定

质膜蛋白在细胞功能中起关键作用，许多人类疾病与膜蛋白功能异常有关。许多药物与细胞表面受体和转运体结合，从而调节下游信号级联，最终实现其疗效。事实上，靶向膜蛋白的药物占目前fda批准的小分子药物的60%以上。然而，膜蛋白的低丰度和生物物理性质阻碍了药物与膜蛋白之间靶点结合的评估。这是一种用于发现药物膜蛋白靶点的替代TPP策略，其中细胞溶解步骤是通过温和的洗涤剂(大多为0.4% NP-40)实现。然而，单一温和的去污剂可以同时提取膜蛋白和其他可溶性蛋白，但完整的膜蛋白提取仍然难以实现。2021年，Kalxdorf等开发了一种改进的TPP策略，实现了对质膜上蛋白质热稳定性和丰度的选择性评估，命名为CS-TPP(图3)。与传统的TPP工作流程不同，在活细胞样本的热应激后，细胞膜蛋白被偏碘酸钠氧化，然后通过肟连接反应进行生物素化。接下来，通过过滤步骤从可溶性蛋白质部分去除蛋白质沉淀物后，将这些生物素化的蛋白质富集到neutravidin珠上。样品经珠状胰蛋白酶消化后，引入多重定量LC-MS /MS进行膜蛋白鉴定。哇巴因是一种从gratus中分离的强心苷，其主要作用靶点为Na+/K+- atp酶亚基ATP1A1, ATP1B1和ATP1B3。虽然基于温和去势剂细胞裂解的TPP策略未能鉴定出其已知靶点，但在将CS-TPP应用于活K562细胞的实验中，所有这些atp酶亚基均被鉴定为哇巴因的直接靶点，这表明CS-TPP具有发现天然产物膜蛋白靶点的重要潜力。

图3 CS-TPP、STPP、TS-FITGE和PSTPP流程用于生物活性天然产物的靶点鉴定。(A) CS-TPP工作流程:首先将细胞样本分装，并用天然产物或载体处理指定时间。在不同温度的短时间热刺激后，细胞膜蛋白被氧化和生物素化，随后膜蛋白组在中性粒细胞微球上富集。膜蛋白组经珠状胰酶消化后可引入tmt - MS蛋白质组学，用于膜蛋白的鉴定和膜蛋白熔解曲线的建立。(B) STPP工作流程:通常，热挑战只在一个确定的温度和一个饱和NP浓度下进行。在多重质谱分析后，通过直接比较NP或溶剂处理样品中可溶性蛋白丰度的倍数变化来实现目标鉴定。37℃的STPP建议作为实验对照。(C) TS-FITGE流程:在一定温度下热挑战后，溶剂处理和np处理的样品中获得的可溶性蛋白质组分别用荧光染料Cy3和Cy5标记，然后通过2D凝胶电泳分离。自动图像分析可定量凝胶中各蛋白点的Cy5/Cy3荧光信号比值，并建立各蛋白点的熔解曲线。最后，通过建立的蛋白质斑点数据库或LC-MS /MS分析对凝胶斑点中的候选靶点进行鉴定。(D) PSTPP工作流程:在蛋白质变性温度范围内(通常为5个温度)进行热应激后，将可溶性蛋白质组和沉淀蛋白质组引入LC-MS /MS，分别分析蛋白质组的热稳定性。只有在可溶性和沉淀蛋白质组中具有互补热位移信息的蛋白质被鉴定为靶蛋白。

简化的TPP (STPP)用于天然产物的靶标识别

在标准的TPP程序中，在药物或溶媒处理下，在10个温度点建立熔解曲线，TPP实验重复2次，共得到40个样品。由于使用昂贵的同位素TMT标记试剂，以及由于需要检测大量样品而导致的MS运行时间长，极大地限制了常规TPP策略在天然产物靶标鉴定中的广泛应用。简化TPP (Simplified TPP, STPP)是常规TPP的简化版，用于检测和定量在一个药物浓度和三个温度点以下的全蛋白质组的热稳定性。细胞靶点不再通过观察熔解曲线和Tm位移来鉴定，而是通过在单一实验温度下去除加热诱导的沉淀蛋白后，直接比较药物或溶媒处理的样品中可溶性蛋白丰度的倍数变化来鉴定(图3)。此外，STPP允许使用TMT以外的多种同位素标记方法进行全蛋白质组的MS定量，如氨基酸稳定同位素标记(SILAC)和二甲基标记。与常规TPP相比，STPP减少了样品数量，降低了同位素标记试剂成本，缩短了MS仪器使用时间;因此，它被认为是一种更简单、更方便的快速靶向发现药物或天然产物的策略。

STPP具有一些独特的特性，包括简单的实验设计、简化的工作流程和可与传统TPP媲美的靶点识别能力，这可以大大促进与天然产物药理学活性相关的MoAs的阐明，而不需要高的实验成本和漫长的实验时间。尽管如此，当STPP策略应用于天然产物的全蛋白质组靶点鉴定时，需要仔细考虑。首先，加热温度的选择对于STPP实验获得良好结果至关重要。事实上，STPP中的加热温度并不是固定的，加热温度主要取决于各种生理环境下不同的热蛋白质组和感兴趣的蛋白质的熔化特性。与TPP-CCR的温度选择原则相似，STPP温度应在溶媒组中大多数蛋白在热激发后能够聚集和沉淀的熔解温度范围内，从而确保对药物结合蛋白和未结合蛋白丰度差异的显著观察。虽然温度范围相对较宽，但建议STPP温度为47°C至60°C。也有较高的温度，这可能为药物诱导的蛋白质热稳定性设定更严格的标准，从而减少假阳性结果。其次，多种STPP策略有一个共同的缺点，即目标识别的灵敏度可能会因为使用的温度点比TPP少而降低。解决这一问题的有效方法是通过增加STPP样本的重复来增加目标蛋白鉴定的统计置信，以达到与TPP相似的结果。提高加热温度点可能是提高STPP可靠性的另一种替代方法。此外，进一步的无细胞和基于细胞的靶点验证对于排除错误识别至关重要。第三，通过比较单温度加热下药物结合前后蛋白丰度的变化来进行活细胞中STPP的靶点鉴定，但如果这种变化是由于药物影响的蛋白表达或PTMs而不是热稳定性造成的，则可能会出现假阳性靶点鉴定。因此，可能需要在生理温度37℃下建立STPP对照组来证实药物治疗是否影响蛋白表达。虽然STPP还存在一些有待解决的问题，但随着其进一步优化和发展，我们相信STPP可以成为快速、经济有效地鉴定天然产物靶点的有价值平台。

基于热稳定性位移的2D凝胶电泳荧光差异(TS-FITGE)用于天然产物的靶点鉴定

另一种性价比高的TPP简化策略是使用2D凝胶电泳代替定性MS进行蛋白质组鉴定和定量，命名为TS-FITGE或2D差异凝胶电泳CETSA (2DE-CETSA) (图3)。与常规的TPP工作流程相似，药物或溶剂处理的细胞样本在一定温度下经热诱导热变性后，通过高速离心获得可溶性蛋白。之后，在溶剂处理的蛋白质组(Cy3，绿色)和药物处理的蛋白质组(Cy5，红色)中加入不同的荧光染料。将两组在相同温度下的染料结合蛋白质组进行混合，然后进行二维凝胶电泳分离。通过自动图像分析可以定量凝胶中各蛋白点的Cy5/Cy3荧光信号比值，然后根据所有测试温度点的Cy5/Cy3信号比值建立各蛋白点的熔解曲线。最后，通过建立的蛋白质斑点数据库或LC-MS /MS分析鉴定凝胶斑点中的候选靶点。与TPP相比，TS-FITGE法的显著优势在于不需要使用高成本的稳定同位素标记试剂，大大降低了实验成本。TS-FITGE通过区分红点(Cy5:Cy3比值>1，热稳定)或绿点(Cy5:Cy3比值< 1，热不稳定)与其他背景黄点，可以直观地识别目标蛋白点。此外，TS-FITGE通过观察未加热的凝胶中是否出现红色或绿色斑点，可以很容易地区分药物下游作用引起的彩色蛋白斑点和热稳定性变化引起的彩色蛋白斑点。

沉淀支持的TPP (PSTPP)用于纳米粒子的靶点鉴定

在传统的TPP工作流程中，经过热挑战后，超速离心法将细胞蛋白质组分为两个部分:可溶性蛋白质部分和沉淀部分。然而，只有可溶性部分被定量MS进一步分析以提供药物诱导的稳定性变化信息，而含有互补热蛋白质组信息的沉淀部分总是被忽略和丢弃。在最近的一份报告中，Ruan及其同事开发了一种名为PSTPP的改良TPP策略，该策略整合了来自可溶性和沉淀部分的药物诱导的稳定性转移信息，从而提高了药物靶点识别的灵敏度和特异性(图3)。与TPP的10个温度点不同，PSTPP实验仅在能够显著诱导蛋白质变性和沉淀的温度范围内进行(一般为5个温度，47 ~ 59℃)。因此，与TPP相比，PSTPP的实验流程更加简化，工作量和实验成本仅约为TPP的一半。经过热应激和离心后，将可溶性蛋白部分和沉淀蛋白部分引入LC-MS /MS，分别分析蛋白质组的热稳定性。只有在可溶性和沉淀蛋白质组中具有互补热位移信息的蛋白质被确定为目标蛋白质。PSTPP被认为是一种TPP方法，用于更严格和敏感的靶点识别。其在未来精准、快速鉴定天然产物靶点方面的潜力值得关注。

TPP策略用于NPs的脱靶和毒性靶点识别

除了确定生物活性天然产物的活性靶点外，TPP平台还可用于寻找有毒天然产物的毒性靶点，从而揭示这些天然产物毒性的原因。例如，tutin是从马桑属植物中分离出来的，是一种公认的毒性化合物，常用于建立急性癫痫动物模型。通过采用TPP-TR策略(37 ~ 67℃)，确定tutin诱导的癫痫的毒性靶点为钙调神经磷酸酶。随后的WB-CETSA和验证数据表明，tutin可以激活钙调神经磷酸酶，导致癫痫发作。脱靶效应与药物的疗效和不良反应密切相关。TPP方法在识别靶向药物脱靶方面具有巨大潜力。例如，基于HDAC抑制剂panobinostat的临床副作用，2D-TPP平台将TTC38和PAH确定为脱靶。在另一项研究中，TPP策略揭示了PIP4K2A和ZADH2是polo样激酶1 (PLK1)抑制剂volasertib的脱靶作用，该药物正在进行3期临床试验。此外，fda批准的抗病毒药物瑞德西韦(remdesivir)的宿主细胞靶点通过tp - tr策略确定，以更好地理解该药物的脱靶与其对非感染细胞的疗效之间的关联，TRIP13被发现是瑞德西韦的脱靶。阐明药物脱靶对药物的进一步精细化和未来的临床药物开发具有重要意义。然而，天然产物的脱靶识别仍然有限。

高通量(HT)-CETSA策略天然产物先导药物发现

药物发现活动通常从高通量筛选(HTS)开始，旨在快速识别具有开发成针对感兴趣蛋白的药物潜力的命中化合物。经典的WB-CETSA是一种检测候选药物分子靶向结合的强大工具，通常使用Western blot检测作为读出。但由于其低通量、耗时的特点，不适合大规模靶向药物筛选。高通量(HT)-CETSA策略在经典的CETSA基础上进行了改进，用定量、自动化、高密度的微孔板读出取代了低通量、高强度的Western blot读出，从而为同时测定多种药物在自然环境中的靶点结合提供了强大的检测能力，极大地帮助了药物发现的早期阶段的靶点识别。迄今为止，HT-CETSA已成功小型化到标准96孔、384孔甚至1536孔的微量板格式，并已成功应用于一些目标结合物的高通量筛选，使用不同的读出方法。经典的WB-CETSA向高通量检测格式的转变需要解决多种挑战，例如，简化化合物处理、热变性和细胞裂解步骤，消除所有洗涤和离心步骤，以及引入自动化操作以节省时间。更重要的是，我们非常需要引入一种适合于均相读数的微孔板检测系统，以在热应激和细胞裂解后聚集的蛋白和细胞碎片的背景下，选择性地定量剩余的药物稳定的可溶性靶蛋白。基于以上原理，目前已建立了几种HT-CETSA检测方法，一般可分为两类:(1)HT-CETSA- immunoassay，基于使用特异性靶抗体的不同高通量免疫检测读数，包括AlphaScreen、免疫荧光和声学反相蛋白阵列(aRPPA);(2) HT-CETSA-Reporter，该方法基于高通量β-半乳糖苷酶或纳米荧光素酶依赖性的发光读数，并且存在报告标记的靶蛋白(图4)。为了节省时间和成本，HT-CETSA实验通常在等温条件下进行，这意味着热激发只需要一个温度(通常是ITDR温度)，该温度可以在所关注蛋白质的WB-CETSA中计算Tm后定义。CETSA的小型化微量板格式不仅可以测定化合物库的热稳定性，还可以同时测定一组化合物在等温条件下的ITDR曲线，使我们可以根据计算出的EC50值对被测化合物的细胞效价进行排序

图4 从NP文库中发现药物的HT-CETSA策略示意图概述(A和B) ht - cetsa -免疫测定:(A)收集活细胞，重悬，并分配到96孔、384孔或1536孔微量板中。随后分发NPs或DMSO并且在37℃下孵育指示时间(通常0.5-2 h)。然后，使用温控器或水浴器在预定的温度下加热平板并指定时间(一般为3 min)，然后冷却1 min。在细胞裂解步骤(一般为NP-40裂解缓冲液)后，任选地通过低速离心去除细胞碎片和蛋白质聚集物。然后将等分的裂解产物转移到用于AlphaScreen的检测板或用于aRPPA的源板。最后，按照AlphaScreen或aRPPA方法的标准方案进行检测。(B)将活细胞重悬并以低密度接种到微量板中。经过NP孵育和热激发步骤后，粘附的细胞在抗体孵育前被固定、渗透和封闭。最后，获得免疫荧光图像来量化np引起的热位移。(C) ht - cetsa -报告基因法:通过转染将目标蛋白附加小报告基因标签(如ePL, 86b, HiBiT)导入活细胞，然后分配到微量板中。在NP孵育和热激发步骤之后，板中的细胞被裂解，然后通过添加大的报告片段和底物来重新构成报告活性。最后，可以检测基于报告基因的发光(ePL-EA互补β-半乳糖苷酶活性，86b-11S和HiBiT-LgBiT互补Nanoluciferase活性)。

ht-cetsa-先导药物发现的免疫测定

基于alphascreen的检测是第一个开发的ht - cetsa兼容的高通量筛选方法，该方法使用与供体和受体珠融合的特异性抗体定量内源性蛋白水平，当接近时，通过能量转移产生化学发光信号。在一项研究中，研究者对瑞典化学生物学联盟的10,928种化合物的文库进行了筛选，目的是通过alphascreencetsa平台在活K562癌细胞中鉴定出有效的胸苷酸合成酶(TS)抑制剂。活性化合物的阈值设定为100 nM雷替曲塞(阳性药物)的11.7%稳定，并确定了65个hit，包括已知的TS药物和抑制剂，如CBK115334和地西他滨。通过AlphaScreen在完整的癌细胞中建立了HT-CETSA测量雄激素受体(AR) 、B-Raf和PARP1与其结合物的直接靶点结合。然而，这种AlphaScreen-CETSA方法需要制备大量均质细胞悬液，其中的胰蛋白酶和重悬过程可能会导致贴壁细胞的细胞生理学和靶药理学改变。利用96孔或384孔微孔板的高含量免疫荧光(HCIF)成像技术，CETSA被扩展为一种名为HCIF-CETSA的高通量方案，从而可以直接定量贴壁活细胞中的药物-靶点结合，并获得可在单细胞水平测量的空间分辨的靶点结合信息。通过确定Chk1或p38α与其已知抑制剂之间的靶点结合，这一方法的兼容性已得到验证，并且与AlphaScreen相比，将HT-CETSA移动到成像读数时，所需要的细胞数量要少得多。此外，通过原位HCIF-CETSA平台在粘附的A431细胞中筛选了以激酶为中心的1,120种化合物，以识别p38α结合物，从而确认了14个命中值和1%的命中率(> 30%稳定)。最近，以96孔板或384孔板格式开发了名为HT-CETSA-aRPPA的高通量CETSA方案，其中基于免疫印迹的aRPPA被用作检测药物稳定的可溶性蛋白的读数。该检测法首先使用LDHA和29种LDHA抑制剂进行验证，然后发现该检测法能够显著地从123种激酶抑制剂中识别MEK1抑制剂。虽然这些HT-CETSA策略在hit发现方面取得了重大进展，但它们受到现有靶向特异性抗体的极大限制。例如，AlphaScreen-CETSA要求目标特异性抗体对具有与能量转移相容的不同表位，HCIF-CETSA只有在单个抗体在变性和聚集蛋白背景下选择性地报告天然蛋白时才有可能，并且抗体特异性对于CETSA-aRPPA的蛋白检测至关重要。

HT-CETSA和生化筛选先导药物发现的联合策略

在早期药物发现中，一个持续存在的问题是，通过基于纯化蛋白的生物化学筛选试验获得的先导化合物的活性往往由于复杂的因素(如细胞通透性不足和药物代谢)而在随后的疾病相关细胞表型分析中降低或丧失。HT-CETSA策略能够直接评估活细胞中的靶点结合，从而在生化检测和细胞表型检测之间建立有意义的联系。多项研究表明HT-CETSA与生化测定结果具有良好的相关性。然而，与生化筛选相比，HT-CETSA对先导化合物的活性确认有更严格的筛选标准，因为它是直接在活细胞环境中进行的。因此，构建一个由生化筛选(与纯化蛋白的结合活性)、HT-CETSA(与活细胞的药物靶点结合)和细胞表型分析(功能性细胞效应)组成的漏斗型筛选平台，展示了快速、准确地鉴定铅的潜在优势，该平台已被应用于从72,000个化学实体中发现NUDT5抑制剂和来自158,410个化合物的IP6K1抑制剂。此外，通过直接比较高通量ITDR实验中确定的EC50值，HT-CETSA具有可靠的能力在细胞靶点结合中对化合物的效力进行排序，这显著推动了结构-活性关系研究，并指导药物发现筛选级联的领先优化。

虽然报道的HT-CETSA方法是在活细胞中进行的，但毫无疑问，它们也适用于细胞裂解物和组织样本。近年来，HT-CETSA平台得到了大量发展，并成功实现了多种靶点与其活细胞中已知或未知结合物之间靶点结合的高通量定量。然而，目前尚无应用于从天然产物文库中高通量筛选目标结合物的报道。鉴于HT-CETSA的简单性和高相容性，它很容易转化为生物活性天然产物的筛选平台。生化筛查与HT-CESTA联合策略可能更适用于具有生物活性的NP筛查。天然参悟是发现先导化合物的重要来源，通过HT-CETSA策略成功命中天然靶点抑制剂或激活剂对后续新药开发具有重要意义。我们期待未来进一步努力利用HT-CETSA策略从天然产物中发现药物。

中药靶点发现的CETSA策略

中药或中药组方因其化学成分的复杂性、作用靶点的多样性以及不良反应小等特点，在治疗复杂性疾病方面具有独特优势。靶点发现一直被认为是阐明中药MoAs的核心，也是建立中药化学成分与表型疗效关联的关键。然而，中药“多组分、多靶点、多水平”的特性导致许多传统的靶点筛选方法不适合快速发现中药靶点，如化学蛋白质组学，这使得靶点发现成为限制MoAs阐明和中药进一步临床应用的瓶颈。目前，揭示中药或中药方剂作用于细胞或生物后引起的整体基因组、转录组和蛋白质组的变化是揭示中药MoAs的常用方法。然而，这些组学水平的信号变化是间接的，不能直接揭示与其表型相关的中药的细胞靶点。近十年来网络药理学的兴起引起了人们对中药moa整体图谱的关注，但该技术获得的结果多基于计算预测而非真实靶点分析。CETSA因其无化学修饰、易于操作的特点，不仅被广泛用于单一天然产物的靶点发现，也被作为化合物混合物、植物提取物或中药靶点研究的有效策略。在CETSA中，中药被视为一个单一的药物样本，从而能够在细胞或组织水平直接测量靶点的结合。因此，即使中药的化学成分未知或未完全揭示，靶点结合信息也是可测量的。CETSA揭示的靶点接合效应并非由单一成分所致，而是多种中药成分共同作用的结果。虽然利用TPP策略发现的靶点尚未见报道，但大规模的热蛋白质组学分析无疑可以加速中药靶点的鉴定和机制的阐明。在完整细胞中实施TPP，既可以揭示中药复杂成分的直接作用靶点，也可以揭示靶点结合对下游信号通路的干扰，从而使从整体角度分析中药MoAs成为可能。疾病部位及其他器官的组织水平热蛋白质组学分析可提供丰富的中药靶点疗效、组织分布及脱靶不良反应信息。这种新的靶点发现模式可命名为"中药热蛋白质组图谱(TCM-TPP)"。但值得注意的是，TPP只能获得中医的整体目标群体，而不能获得各组成部分与目标之间的一对一对应信息。因此，仅利用TPP研究中药的直接作用靶点尚不够，需要结合其他方法来阐明中药抗疾病的"成分-靶点-通路-治疗效应"机制网络。一种可能的策略是引入分子对接技术，将中药成分与tpp确定的靶点逐一进行对接，从而建立预测性的成分-靶点一对一关系。在此之后，这些关键的预测成分-靶点相互作用可以通过WB-CETSA实验进一步验证。之后，通过定量蛋白质组学发现的差异表达蛋白(DEPs)可以为tpp识别的靶点网络增加更全面的间接调控信息，从而建立完整的中药作用机制网络。当然，这些策略需要建立在中药化学成分不断澄清的基础上，植物化学家的努力是必不可少的。进一步探索基于cetsa的策略与其他方法和其他学科的整合和延伸，对阐明中医的MoA具有重要意义。

CETSA策略用于NP研究的利弊及未来展望

药物的疗效主要取决于其与靶点的结合程度，而不良反应通常是由易发生毒性的脱靶结合引起。从最初的打击发现到临床前和临床研究，药物的靶向性都需要监测和控制。基于配体诱导靶蛋白热稳定的原理，2013年发明的CETSA方法为生理学相关背景下的直接细胞靶点结合提供了一个强大的工具。经过近十年的发展和优化，CETSA策略在广泛的模式生物中表现出普遍适用性，在药物发现和开发的各个阶段都取得了实质性的进展，包括经典的WB-CETSA策略、TPP(或MS-CETSA)策略和HT-CETSA策略(图5)。

综上所述，基于CETSA和tpp的热蛋白质组数据可以从多种细胞来源、模式生物甚至人类患者中产生。这些数据的积累可以显著加快药物铅的发现、MoAs和副作用的阐明以及NP药物的优化和开发，为针对某些疾病的药物治疗提供有力的证据。CETSA策略不仅可以在临床前药物发现的各个阶段发挥重要作用，而且可以为临床阶段的合理用药提供指导。CETSA的战略必将带来远远超出初始投入的巨大回报，为未来基于纳米粒的药物研发开辟更多的可能性。

Tu Y, Tan L, Tao H, Li Y, Liu H. CETSA and thermal proteome profiling strategies for target identification and drug discovery of natural products. Phytomedicine. 2023 Jul 25;116:154862. doi: 10.1016/j.phymed.2023.154862.

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