触发PD-L1降解！浙江大学发文：发现肿瘤免疫治疗新药

【导读】细胞内分布和运输过程对于维持程序性死亡配体1 (PD-L1)的表达至关重要，干预这一细胞过程可能带来有前景的治疗策略。

9月4日，浙江大学研究团队在期刊《Advanced Science》上发表了研究论文，题为“Zosuquidar Promotes Antitumor Immunity by Inducing Autophagic Degradation of PD-L1”，本研究中，通过基于细胞的高含量筛选，研究人员发现ABCB1调节剂唑喹达通过触发PD-L1的自噬降解显著抑制其表达。在机制上，ABCB1与PD-L1相互作用，并损害COPII介导的PD-L1从ER(内质网)到高尔基体的转运。唑喹达的治疗增强了ABCB1-PD-L1的相互作用，并导致PD-L1滞留在ER中，随后在SQSTM1依赖的选择性自噬通路中降解。在CT26小鼠模型和人源化异种移植小鼠模型中，唑喹达显著抑制肿瘤生长，并伴有细胞毒性T细胞浸润的增加。综上所述，本研究表明ABCB1是PD-L1的负调控因子，而唑喹达可能通过在早期分泌通路中触发PD-L1的降解而作为潜在的免疫治疗药物。

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202400340

背景知识

01

肿瘤细胞表面表达的PD-L1(程序性死亡配体1)经常上调，通过与T细胞表达的PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)相互作用来逃避免疫监视。靶向PD-1-PD-L1轴的单克隆抗体在多种实体肿瘤中显示出显著的临床获益，但免疫相关不良反应(irAEs)、内源性或获得性耐药、静脉给药方式等缺点严重限制了PD-1-PD-L1抗体的临床应用。越来越多的证据表明，研究人员有机会开发基于调控机制调节PD-L1表达的小分子药物。JQ1、eFT508和姜黄素等化合物分别在转录、翻译和翻译后水平降低PD-L1的表达，从而抑制体内肿瘤的生长。维替西林A还通过抑制CD274启动子上mll1介导的H3K4me3来降低PD-L1的丰度。一系列激酶抑制剂包括渥曼青霉素(磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂)、托法替布(Janus激酶抑制剂)和雷帕霉素(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂)也显示出对PD-L1表达的显著抑制作用，并已进入临床前或临床试验。因此，开发基于PD-L1表达调控的小分子药物可能为免疫治疗带来有前景的策略。

最近的研究强调了细胞内转运过程在PD-L1表达和免疫抑制功能中的关键作用。研究发现，CMTM6和SGLT2的表达可以通过诱导内化的PD-L1循环回到细胞膜来稳定PD-L1。去除CMTM6和卡格列净对SGLT2的药理学抑制均通过触发PD-L1降解表现出显著的抗肿瘤效率。此外，钙蛋白酶被证明可以诱导负载PD-L1蛋白的再循环内体(RE)转移到质膜。氨氯地平通过抑制钙流触发RE上PD-L1的自噬降解，从而增加肿瘤组织中CD8+ T细胞的浸润。此外，诱导PD-L1重新分布到线粒体也有利于克服三阴性乳腺癌的化学免疫治疗耐药。另外，抑制PD-L1从内质网(ER)转运到高尔基体也显示出足够的肿瘤抑制作用。一些化合物如二甲双胍和BMS1166破坏PD-L1的n -糖基化修饰，从而阻止其内质网输出并触发内质网相关降解。甲状腺腺瘤相关基因(THADA)参与PD-L1的内质网向高尔基体的运输，THADA缺失导致了内质网的滞留和PD-L1的降解。因此，探索PD-L1胞内分布的调控机制和关键调控因子将有利于靶向PD-L1小分子抑制剂的开发。

唑喹达通过SQSTM1依赖的选择性自噬诱导PD-L1降解

02

为了探索唑喹达下调PD-L1的分子机制，研究人员研究了唑喹达对PD-L1蛋白稳定性和mRNA水平的影响。研究人员发现唑喹达显著缩短了PD-L1蛋白的半衰期，而对mRNA水平没有影响。此外，与蛋白酶体抑制剂MG132相比，溶酶体抑制剂NH4Cl抑制了唑喹达介导的PD-L1降解，表明唑喹达通过溶酶体依赖途径促进PD-L1的降解。

图1：通过选择性自噬途径诱导PD-L1降解

研究人员提出了唑喹达介导的PD-L1降解是否依赖自噬的问题。为了验证这一假设，研究人员使用LC3作为自噬的标志物来研究唑喹达的作用。如图1B,C所示,唑喹达以剂量和时间依赖性方式诱导LC3-II的表达。LC3-II的表达在3个原发性患者来源的肺癌细胞中也被检测到。由于mCherry和GFP荧光蛋白在酸性环境中表现出不同的稳定性，考虑到抑制自噬流也会诱导LC3-II的积累，研究人员在NCI-H460细胞中转染LC3-mCherry-GFP质粒来监测自噬流。自噬体(黄色)和自噬溶酶体(红色)数量增加，提示唑喹达可激活自噬。透射电镜分析也显示唑喹达处理后细胞自噬激活。此外，唑喹达可增强PD-L1与LC3的共定位。为了进一步验证自噬在唑喹达介导的PD-L1降解中的作用，研究人员通过siRNA分别沉默自噬体形成所必需的ATG5和ATG7。如图1G所示，ATG5或ATG7的缺失干扰了唑喹达诱导的PD-L1降解。综上所述，这些结果表明唑喹达通过自噬-溶酶体途径降低PD-L1的表达。

为了确定哪些SAR(s)可能参与了唑喹达诱导的PD-L1自噬降解，研究人员进行了免疫共沉淀(Co-IP)实验。研究包括了一些经典的SARs，如SQSTM1, TOLLIP, HDAC6和NBR1。如图1H所示，只有SQSTM1与PD-L1的相互作用在唑喹达处理后增加。免疫荧光法检测唑喹达诱导的PD-L1和SQSTM1共定位。此外，SQSTM1的敲除可以抑制唑喹达诱导的PD-L1降解，而其他SARs则没有类似的作用。综上所述，这些结果表明唑喹达通过SQSTM1依赖的选择性自噬促进PD-L1降解。

唑喹达通过其靶点ABCB1抑制肿瘤生长

03

为了进一步证实唑喹达介导的PD-L1降解依赖于ABCB1，研究人员利用crispr-Cas9技术构建了Abcb1a/b敲除的CT26细胞。Abcb1a/b敲除的CT26细胞中mPD-L1表达增加，体外细胞增殖不受ABCB1敲除的影响。随后，研究人员将野生型和Abcb1a/b敲除的CT26细胞分别接种到BALB/c小鼠皮下，并分别给予或不给予唑喹达处理。研究显示，在没有唑喹达处理的情况下，ABCB1的缺失轻微地诱导了肿瘤的生长，这可能与Abcb1a/b敲除后PD-L1表达增加有关。此外，在Abcb1a/b敲除组中，唑喹达对肿瘤生长的抑制作用被消除，且不影响体重。同样，当Abcb1a/b被敲除时，唑喹达诱导的PD-L1下调和肿瘤中CD3+和CD8+ T细胞浸润的增加也被损害。综上所述，这些结果表明唑喹达介导的PD-L1降解和肿瘤生长抑制非常依赖于ABCB1的表达。

研究小结

04

综上所述，研究人员发现唑喹达是一种有效的PD-L1降解剂，它可以破坏PD-L1从内质网到高尔基体的转运，并通过SQSTM1依赖的选择性自噬途径促进PD-L1的降解。研究人员还揭示了ABCB1在负调控PD-L1表达中的重要功能。综上所述，本研究工作从干预PD-L1运输的角度为触发PD-L1降解提供了一种有效的策略。

【参考资料】

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202400340

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