Nature丨肝脏微环境的奥秘：Plexin B2如何成为肿瘤转移的“帮凶”

撰文 | 咸姐

大多数癌症死亡是由转移引起的，这是一个癌细胞设法逃离原发肿瘤，在危险的淋巴血管系统中存活下来，最终在远处器官形成继发性肿瘤的过程。不过，这也是一个极具挑战性的过程，尽管原发性肿瘤会不断地将大量癌细胞释放到全身循环中，但只有<0.02%的播散性肿瘤细胞（DTC） 能够形成明显的转移灶。因此，尽管肿瘤播散可以在癌症进展的相对早期发生，有时甚至在肿瘤前阶段，但原发肿瘤的形成与转移的临床表现之间往往存在较长的间隔时间【1】。可见，启动转移性生长的能力是癌症进展过程中的主要瓶颈，这无疑给我们提供了治疗干预的理想窗口：识别影响转移过程的因素，便可以在转移最脆弱的点——即促进生长的转移微环境建立之前——有效针对转移。癌症进展过程中的这一主要瓶颈提示存在着转移性播散的环境限制，事实上，人们早已认识到宿主器官的微环境条件对于转移性播散的重要性，“种子和土壤”假说认为，转移细胞只会在有利的环境中播种和定植【2】。然而，由于追踪单个外渗肿瘤细胞的技术难题，而经典的回顾性分析虽可以确定允许转移长期发展的因素，但无法捕捉转移播种的早期事件，也无法区分导致转移生长的原因或结果的细胞相互作用，DTC在外来器官环境中的适应和存活的环境决定因素在很大程度上仍然不清楚，目前仍然缺乏对转移接受器官发出促进或抑制继发性肿瘤建立的信号的全面概述。

近日，来自瑞士苏黎世联邦理工学院的Andreas E. Moor团队于Nature上在线发表题为In vivo interaction screening reveals liver-derived constraints to metastasis Costanza的文章，设计了一种筛选方法，可用于体内细胞-细胞相互作用的功能测试，旨在识别在DTC播散时决定其命运的宿主来源的因素。同时将该方法应用于阐明肝细胞来源的信号促进或抑制结直肠癌 （CRC） 肝转移的播种，以此确定plexin B2是DTC肝脏定植的关键宿主来源调节因子，并揭示了其作用机制，为肝转移的预防提供了一种新的治疗策略。

按细胞数量计，肝细胞占肝脏的60%，按质量计则占肝脏的80%。可以想见，早期与这些细胞的相互作用可能会影响外渗的DTC形成转移灶的能力。为了验证这一点，本文研究人员开发了一种实验策略，用于在接种过程中对肝细胞-肿瘤相互作用进行汇集性地干扰。首先，利用CRISPR介导的转录激活 （CRISPR-a） 在肝细胞中稳定地过表达数百个基因，从而形成包含多个受扰环境的“马赛克肝脏”；然后，通过脾内注射将肿瘤细胞输送到肝脏。此时，与过表达播种促进因子的肝细胞相互作用的DTC会定植并生长，而与过表达抑制因子的肝细胞相互作用的DTC将无法形成转移。因此，干扰对播种的影响就可以通过相应的sgRNA在转移或非转移区域的富集来推断，其分别代表着促进或抑制播种的作用，即使没有直接观察到受干扰的播种事件，也可以通过转移的存在来回顾性评估其结果（图1）。注射一周后，利用荧光激活细胞分选 （FACS） 分离CD31- CD45- GFP+肝细胞，并从基因组DNA中进行靶向sgRNA扩增，然后进行测序。

图1 筛选方法的示意图

本文研究人员利用独立扩增的sgRNA文库批次进行了三次筛选实验，发现神经营养因子很有可能是肝脏转移种植的促进因子。随后，研究人员利用具有广泛肿瘤-肝脏边界的人结直肠癌肝转移的空间转录组学数据，结合已发表的单细胞RNA测序 （scRNA-seq） 数据进行细胞类型反卷积，同时结合突变数据分析，证明了该筛选平台能够捕获疾病相关的相互作用，并提示肝细胞衍生的趋化因子 （hepatocyte-derived chemoattractants） 和轴突引导信号 （axon guidance cues） 是肝脏转移定植的调节因子，其中plexin B2可能参与了肝细胞和转移细胞之间的直接相互作用。

Plexin B2在大多数小鼠组织的上皮细胞中广泛表达，定位于基底侧膜。利用腺相关病毒 8 （AAV8） 将靶向Plxnb2的sgRNA广泛递送至小鼠肝细胞，与筛选结果一致，plexin B2过表达可以促进转移，且其促进播种的作用适用于多种经常转移到肝脏的癌症；相反，plexin B2的缺失则阻止了肝转移瘤的转移性生长。研究人员还发现，在稳定状态下，plexin B2在肝细胞中广泛表达，在门管区表达较高。值得一提的是，尽管plexin B2免疫反应性在肿瘤周围肝细胞中较高，但其在患有CRC的小鼠肝脏中的表达没有改变，表明plexin B2不是由原发性肿瘤分泌因子或全身作用上调的，而是由于对肝转移存在的局部反应。肿瘤周围肝细胞中plexin B2的存在是转移播种所必需的，但不是维持生长所必需的。组织学分析显示，肝脏plexin B2的水平显著改变了CRC转移灶的形态和微环境，但实验结果显示，转移性的增加不是由于plexin B2过表达诱导的肝脏环境的改变，而是直接引起肿瘤-肝细胞的相互作用。

进一步对plexin B2控制肝脏定植的机制进行研究，实验结果显示肝细胞源性plexin B2是CRC肝转移上皮化的诱导因子，EMT的逆转是DTC定植和适应肝脏环境所必需的。与此同时，研究人员发现，IV类信号蛋白 （plexin B2的经典配体） 介导了肝细胞衍生的plexin B2对DTC的播种促进作用，高信号蛋白的表达标志着原发性肿瘤中具有较高肝转移潜力的亚群。CRC肝转移中信号蛋白的丢失与肝细胞中plexin B2的缺失具有相似的表型，证实plexin B2与肿瘤细胞上的IV类信号蛋白之间的相互作用是KLF4介导的肝转移上皮化的必要诱导因素。这些数据不仅显示了plexin B2-信号蛋白- KLF4信号在促进肝脏定植中的关键作用，也解释了不同肿瘤细胞亚群成功形成肝转移的差异能力。

综上所述，本研究结合转座子技术和荧光微环境标记，开发了一种体内CRISPR激活筛选方法，可系统地研究肝细胞和转移细胞之间的相互作用。研究结果强调了肝实质信号在DTC建立生长促进生态位之前的重要作用，也证明上皮化是CRC转移适应新组织环境所必需的，阻断Plexin-B2信号蛋白轴可消除肝脏的转移性定植，为预防肝转移提供了新的治疗策略。此外，本研究建立的筛选方法评估的是促进转移播种的能力的宿主来源的外部信号，而不是肿瘤的内在因素，因此具有广泛适用性，为筛选其他器官和癌症类型转移的环境限制奠定了方法论框架。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-024-07715-3

制版人：十一

参考文献

1. Celia-Terrassa, T. & Kang, Y. Distinctive properties of metastasis-initiating cells.Genes Dev.30, 892–908 (2016).

2. Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast.Lancet133, 571–573 (1889).

BioART战略合作伙伴

（*排名不分先后）

BioART友情合作伙伴

（*排名不分先后）

转载须知

【原创文章】BioArt原创文章，欢迎个人转发分享，未经允许禁止转载，所刊登的所有作品的著作权均为BioArt所拥有。BioArt保留所有法定权利，违者必究。

BioArt

Med

Plants

人才招聘

会议资讯

近期直播推荐