Nat Commun丨一种探测内源性痛觉阿片肽释放的基因编码传感器

2024年6月25日，瑞士苏黎世大学药理学和毒理学研究所Tommaso Patriarchi团队在Nature communications发表了“Development of a genetically encoded sensor for probing endogenous nociception opioid peptide release”，揭示了开发了一种用于探测内源性痛觉阿片肽释放的基因编码传感器。

Nociceptin/orphanin-FQ（N/OFQ）是一种新近受到重视的关键阿片肽，它在包括动机、压力、进食和睡眠多个行为过程中发挥关键调控作用。由于缺乏高分辨率的方法以适当的空间和时间分辨率检测这种神经肽，哺乳动物大脑中N/OFQ作用的功能意义仍然不清楚。作者开发并表征了NOPLight，这是一种基因编码的sensor，能敏感地检测内源性N/OFQ释放的变化，并对NOPLight的亲和力、药理学特性、光谱特性、动力学、配体选择性以及与细胞内信号转导分子的潜在相互作用进行了体外表征。体内研究利用光纤记录实现了对外源性N/OFQ受体配体结合NOPLight的直接记录，以及在自然行为期间和化学遗传学激活PNOC神经元时，在旁黑质腹侧被盖区（pnVTA）内检测内源性N/OFQ释放。该研究展示了NOPLight可用于在组织和自由行为动物中检测N/OFQ阿片肽信号的动力学。这一进展为研究N/OFQ在多种行为和神经生物学过程中的即时动态提供了强大的工具，有助于深入理解N/OFQ在调节动机行为、应激反应、饮食习惯和睡眠模式等方面的具体作用机制，从而为相关疾病的研究和治疗开辟新的途径。

图一 NOPLight离体特性鉴定

作者首先将传感器直接表达在脑组织中，通过向野生型小鼠下丘脑的弓状核（ARC）注射编码NOPLight病毒。表达4周后，该sensor在ARC中表达。即使在脑切片上灌注低至10nM的N/OFQ，也可以在ARC的感兴趣区域（ROIs）检测到NOPLight的响应，并且随着测试的N/OFQ浓度增加至最高，响应幅度继续增大。接下来测试了NOPLight在体内的灵敏度是否足以在这种离体设置中检测内源性N/OFQ释放。将编码hM3Dq的腺相关病毒注射到PNOC-Cre小鼠的ARC中，使hM3Dq在Cre依赖性下表达，用CNO激活hM3Dq引起了PNOC神经元放电率的明显增加。相应地，可以检测到NOPLight响应的增加，平均荧光变化为ΔF/F0=1.6±0.3%，表明在这些条件下，该sensor能够报告内源性N/OFQ的释放。NOPLight的响应是可逆的，并反映了化学遗传学激活PNOC神经元的时间进程。总的来说，这些结果表明NOPLight不仅能检测脑组织中外源灌注的N/OFQ，也能检测内源性N/OFQ肽的释放，为研究N/OFQ在脑内动态变化提供了有力工具。

图二 NOPLight通过体外NOPR激动剂的激活

体外实验结果显示，小分子NOP受体（NOPR）激动剂Ro 64对NOPLight具有强烈且有效的响应。在野生型小鼠的VTA或ARC区域注射AAV-DJ-hSyn-NOPLight，并在注射位点上方植入了光纤。病毒注射后3-4周，通过腹腔注射给予递增剂量的Ro 64，检测到两个脑区NOPLight荧光的强效、剂量依赖性增加。为了确定在VTA中观察到的NOPLight荧光增加是否是由传感器与NOPR激动剂的结合产生的，在注射Ro 64前30分钟预先给予动物两种不同的选择性NOPR拮抗剂LY2940094或J-113397。两种NOPR选择性拮抗剂完全抑制了激动剂诱导的荧光信号。接下来在VTA中向另外一群OPRL1-Cre小鼠或野生型小鼠注射了含有条件依赖性NOPLight变体的AAV，并在注射位点上方植入了光纤。结果发现，10mg/kg Ro 64注射引起了FLEX-NOPLight信号的显著增强，这一增强与从非条件表达的NOPLight记录到的激动剂诱导信号没有显著差异。相比之下，对照传感器对接种10mg/kg Ro 64没有显示出荧光响应。这些结果表明，在自由活动动物中表达的NOPLight能够可靠地实时检测外源性NOPR激动剂，其检测效果与剂量相关且对抗剂敏感。

图三 NOPLight检测VTA中化学遗传学诱发的内源性N/OFQ释放

开发NOPLight传感器的主要动力之一是最终实现在行为动物中实时检测局部N/OFQ释放。作者利用化学遗传学方法选择性激活VTA PNOC神经元，同时通过光纤记录VTA区域NOPLight荧光的变化，从而在先前确定的旁黑质腹侧被盖区（pnVTA）回路中诱发内源性N/OFQ释放。具体操作如下：PNOC-Cre小鼠在VTA区域同时注射了两种依赖Cre表达的腺相关病毒：i) AAV-DH-hSyn-NOPLight，用于表达NOPLight传感器；ii) 标记有mScarlet的激活型hM3Dq DREADD，并且在注射位点上方植入了光纤。通过注射5mg/kg CNO激活hM3Dq DREADD，导致NOPLight荧光显著增加，而在表达mCherry的对照动物中未观察到这一现象。为了确认这种增加确实是由化学遗传学诱发的内源性N/OFQ释放导致，并且是通过NOPR依赖机制作用的，在CNO注射前30分钟预先给予选择性NOPR拮抗剂LY294009449，防止了CNO诱导的NOPLight荧光增加。这些结果表明NOPLight能够在自由移动的动物中检测到诱发的内源性N/OFQ释放。

综上所述，该研究结果将NOPLight作为一种方法提出，以高时空分辨率改进对内源性阿片肽动态的研究。从体内外两方面表征了NOPLight的表达、选择性和对内源性N/OFQ释放的敏感性。该传感器直接有助于解决长期以来在理解行为时期内源性肽释放实时动态方面的局限性。这类技术的进步不仅能够揭示阿片系统在健康状态下如何精细调节认知和情感过程，还能帮助阐明在成瘾、疼痛、情绪障碍和睡眠障碍等疾病中这一系统功能异常的机制。

文章来源

https://doi.org/10.1038/s41467-024-49712-0

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