脑声问答（34）期丨自由活动小鼠脊髓双光子成像实验相关总结

简介

微型化显微成像技术的发展，将光学显微成像技术与钙离子成像技术相结合，实现了在无束缚环境中对自由活动的动物大脑进行高空间分辨率(μm)和高时间分辨率(ms)的神经活动图像采集，且能容忍微米级的组织运动。微型化双光子荧光显微镜在自由活动状态下小鼠的脊髓成像技术方法，以实现无束缚环境中自由活动的动物脊髓双光子成像。通过采用特定的脊髓固定零件以及固定方法，对无束缚环境中自由活动的动物脊髓前动脉血管进行长期成像。

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脊髓手术

首先建立一种将微型化双光子显微镜植入脊髓的方法，在小鼠自由活动的过程中和接受不同外界刺激时，对脊髓前动脉血管和神经元钙信号变化进行成像观察。手术操作步骤大致如下：

动物饲养于无特定病原体的屏障环境中，照明周期为12h光照/12h黑暗，饲养温度为20～26℃。术后单笼饲养3天至基本恢复后，放回群居饲养笼中正常饲养。

(1)脊髓固定。首先，对小鼠进行称重，采用异氟烷将小鼠深度麻醉，并剔除小鼠背部毛发。然后，沿着脊柱正中央剪开皮肤，采用眼科剪将脊柱紧贴腰段3～6节段的两侧肌肉剪开；将小鼠脊椎骨暴露后，尽可能剥离脊椎骨之间的肌肉组织，暴露出完整的脊柱。接下来，借助定制的脊髓固定装置将脊髓固定零件-V型槽稳定嵌入椎骨两侧以固定脊髓：调整左右两侧V型槽的距离，将腰段3～5节段固定后，调整横突位置使完整的横突置于两侧V型槽中，微调并固定V型槽直至基本消除椎骨的抖动；使用无菌生理盐水冲洗创面至无明显渗血后，用适量的双氧水处理骨头表面至表面剩余肌肉组织萎缩；再次使用无菌生理盐水冲洗至脊椎骨表面无残余组织碎屑后，缝合头尾V型槽两侧多余剪开的皮肤。最后，采用压缩空气瓶吹干脊椎骨表面以及两侧缝合皮肤表面的生理盐水，涂抹3M组织胶水以封闭手术创口周围皮肤和肌肉，并用无尘纸吸附多余的3M组织胶水。

(2)脊髓暴露和V型槽植入。采用颅骨钻打磨选定目标成像节段的椎板，将其磨薄至约25～30µm后，轻轻掀开部分脊椎板，以暴露中央前动脉血管和周围脊髓白质；清理干净脊髓表面，随后采用玻璃盖玻片隔绝暴露的脊髓组织和空气，并用牙科水泥辅助密封；同时，使用牙科水泥将已调整好位置的V型槽稳定地黏附于椎骨两侧，待牙科水泥干透，完成脊髓创口密封和V型槽植入后缝合周围皮肤，涂抹适量碘伏消毒。

手术前将手术器械和零件进行高压灭菌处理。手术过程中使用异氟烷维持麻醉状态，同时保持脊髓暴露位置表面湿润，并采用生理盐水反复冲洗暴露位置，防止病菌感染。术后连续6d进行消炎和镇痛处理。其中，消炎采用兽用青霉素(剂量：0.03g/kg)，腹腔注射，每天1次；镇痛采用盐酸曲马多(剂量：0.3mL/kg)，手术当天及术后2d进行腹腔注射，每天1次。饲养30d后进行活体成像，其中术后第1周尽量单笼饲养以避免小鼠打斗影响手术效果。

活体内双光子荧光显微成像

采用成像视野为420μm×420μm的大视场微型化双光子荧光显微镜，在自由活动的小鼠中进行脊髓前动脉血管成像，以评估无束缚条件下脊髓血管活体成像的图像稳定性与图像清晰程度。此外，对不同运动状态下自由活动的小鼠的脊髓背角神经元钙信号活动进行成像记录，初步分析小鼠在运动过程中脊髓如何编码简单的运动和感觉信息。

小鼠术后恢复30d，将其清醒固定，通过眼窝窦注射20μL浓度为10mg/mL的FITC-dextran标记血管。采用微型化双光子显微成像系统对FITC-dextran标记的脊髓前动脉血管进行成像位点定位后，在脊髓相应位置放置成像套件，并将其和小鼠背部的V型槽进行稳定黏附以固定成像窗口；在确定具体成像区域后，将重量仅2.8g的大视场微型化双光子显微镜镜头用螺丝固定在成像套件中，对脊髓内同一血管结构进行观察和图像采集。直至所有成像测试结束后取下成像套件进行回收。

脊髓前动脉血管长期成像实验中，以植入成像套件当天为起始记录日期(Day1)，每天成像前将微型化双光子显微镜镜头重新放入已经固定好的成像套件中。脊髓背角神经元钙信号记录实验中，将携带遗传编码钙离子指示蛋白基因序列片段GCaMP6s的重组腺病毒注射到脊髓中对脊髓神经元进行标记。待病毒表达和手术恢复30d后，同样采用上述方法对脊髓神经元钙信号活动进行成像。

行为学测试

测试前半小时将小鼠放入行为学测试房间中以适应测试环境，测试均在直径50cm×高50cm的圆形旷场中进行。其中，每项行为学测试前均让小鼠先适应旷场环境1～2min；所有血管图像和行为学视频均为同步记录。

自由活动：将脊髓已植入大视场微型化双光子荧光显微镜探头的小鼠放入圆形旷场中，同时记录小鼠运动状态和脊髓成像共5min用于数据分析。

夹尾处理：用定制的夹子(P＝340g)夹住小鼠尾巴根部持续10s。以夹尾处理的10s时间窗为中点，截取夹尾处理前-中-后各10s，连续30s的行为学视频和对应的同步血管图像作为分析对象。

自由活动的小鼠脊髓前动脉血管的双光子成像在小鼠背部脊髓植入大视场微型化双光子荧光显微镜探头，对自由活动小鼠的脊髓浅层组织进行成像，同步采集圆形旷场中小鼠实时行为学视频和血管图像。其中，脊髓固定装置的设计，是实现微型化双光子显微镜植入脊髓中的前提。借助定制的脊髓固定装置，通过手术将小鼠脊髓暴露并将目标成像区与V型槽相对固定。为评估该方法应用于自由活动的小鼠脊髓成像时的稳定性以及图像质量，将脊髓中央最为明显的前动脉血管作为成像目标，采用FITC-dextran标记之后进行实时脊髓血管图像和行为学视频同步采集。

截取30s自由活动的小鼠行为视频进行分析，对运动速度的变化进行可视化，并对不同速度状态对应的血管成像进行观察。在小鼠运动前、减速运动、最大瞬时速度运动、加速运动4个运动区间的代表性位置点对应的血管图像在小鼠身体头-尾方向(头尾轴)和水平方向(左右轴)均无明显位移且图像清晰。应用微型化双光子显微镜结合脊髓固定装置、脊髓手术，可实现对自由活动的小鼠脊髓前动脉血管的稳定成像。

不同行为状态下的脊髓前动脉血管

双光子成像（分析）

在正常的运动下可实现活体脊髓血管的清晰、稳定成像，但一些剧烈运动往往伴随较大幅度的脊髓无规则运动，可能导致成像目标剧烈晃动而干扰成像质量。为进一步对不同运动状态下活体内脊髓成像质量进行评估，以检验该成像方法结合不同行为学应用的有效性，本研究对小鼠的活动状态进行干预。通过对自由活动的小鼠施加外界刺激使其运动更加剧烈和运动表现多样化，从而实现在不同条件下的脊髓血管图像采集。此外，为量化成像过程中的图像质量，对小鼠身体头-尾方向(头尾轴)，水平方向(左右轴)的血管图像位移进行对比和分析。

采用夹子对自由活动的小鼠尾巴施加压力持续10s，导致其疼痛以诱发蜷缩及舔尾等躯干发生较大幅度的扭动行为，对夹尾前后的脊髓血管图像位移进行量化比较，以评估该条件下血管位移偏差。在夹尾过程中，尽管小鼠出现剧烈的挣扎以及舔尾行为，但血管图像依然稳定，仅有微小范围位移。基于此，对夹尾前和夹尾过程中，以及夹尾前和夹尾后的血管图像进行头尾轴、左右轴位移变化统计，以检验在剧烈运动状态下该成像方法的可行性。结果显示，夹尾刺激过程中头尾轴最大图像位移＜30μm，左右轴最大图像位移＜8μm。

Fig1 自由活动的小鼠脊髓前动脉血管双光子成像

行为干预下的脊髓前动脉血管

长期双光子成像

为评估长期成像过程中，小鼠在剧烈运动时脊髓血管图像所产生的位移偏差能否被有效控制在可接受范围内，在植入成像套件后的第1天、第3天、第5天和第7天对自由活动的小鼠先后进行气流和夹尾处理。实验结果发现，血管结构成像依然清晰，图像质量较为稳定。

夹尾处理能使小鼠身体产生较大程度的弯曲，自然状态下会伴随脊髓较大程度的形态变化。为进一步评估在此过程中本文成像方法是否将血管图像位移控制在理想成像允许范围内，在植入成像套件后的第1天、第3天、第5天和第7天分别对小鼠实施夹尾处理。脊髓血管成像结果显示，血管结构依然清晰完整，无明显的图像扭曲和丢失现象。统计结果显示，每天夹尾前-中和前-后血管图像位移在头尾轴和左右轴均无显著差异，头尾轴图像位移范围保持在14～28μm，左右轴在4～8μm。

Fig2 自由活动小鼠脊髓前动脉血管的长期双光子成像

采用新的手术固定方式从成像的物理层面尽可能地削弱了脊髓的无规则运动，大幅度消除成像采集过程中图像的丢失或伪影，显著提高成像质量，为后期的图像处理简化了流程，实现了在自由活动的小鼠中长期稳定的脊髓双光子成像。

注意事项及总结

为了对小鼠同一脊髓区域进行多次双光子显微镜成像，每次成像完毕后，需要缝合小鼠背部肌肉与皮肤，下次成像时再打开皮肤和肌肉，重新暴露脊髓节段。这种重复手术虽然操作简便，但也存在很多问题，如增加动物感染风险，造成脊髓局部损伤，激活脊髓局部的免疫反应，对动物造成长期疼痛。这些问题都会对动物双光子显微镜活体脊髓成像造成很大干扰，因此研发出一种长期的活体内动态成像观察窗口意义重大。有研究发明了一种小鼠脊柱脊髓固定观察装置，通过将观察窗口植入小鼠腰段脊柱，在暴露的脊髓节段上涂生物硅胶，用玻璃片封闭装置，从而使小鼠能够长期携带观察装置生存，每次成像时将小鼠麻醉后放入外固定架上即可，避免了重复手术对成像带来的干扰。此项发明开辟了长期双光子显微镜活体脊髓成像的新途径。随着长期观察窗口理念的提出，各种改进的观察窗口相继出现，更有利于应用双光子显微镜对活体脊髓进行长时间动态观察。

文献引用：

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