《食品科学》：梧州市六堡茶研究院邱瑞瑾高级农艺师等：“金花”菌的鉴定及接种发酵六堡茶的品质变化

六堡茶属黑茶，是中国历史名茶、国家地理标志保护产品，素以“红、浓、陈、醇”四绝著称，具有降血脂、降血糖、抗氧化、抗菌、保护肝脏等保健功效。微生物对六堡茶品质形成具有重要影响。“金花”菌多为曲霉属（Aspergillus）、散囊菌属（Eurotium）和青霉属（Penicillium），能在茶叶表面产生金黄色闭囊壳，其质量和数量是衡量茯砖茶品质的重要指标。前人研究表明，六堡茶中存在多种“金花”菌，能够分泌淀粉酶和氧化酶，对六堡茶的香气、滋味等物质转化发挥一定作用。六堡茶的“金花”在陈化过程中随机发生，陈化环境中的温、湿度条件对六堡茶发花影响很大，而六堡茶制作工艺中没有专门的发花工序。在六堡茶渥堆过程中也有“金花”菌参与。

梧州市六堡茶研究院、华南农业大学园艺学院的吴新惠、杜金杰、邱瑞瑾*等人根据分离培养特征、光学显微镜结构特征和内源转录间隔区(ITS)序列比对分析，结合系统发育分析等多种鉴定手段，对渥堆过程六堡茶中的“金花”菌进行分离鉴定。将分离到的“金花”菌接种至灭菌六堡毛茶中进行固态发酵，研究不同“金花”菌对六堡茶滋味品质的影响，探索不同“金花”菌之间的差异，筛选优良菌株，以期为六堡茶“金花”菌的开发利用提供科学依据。

1 4 株“金花”菌的分离鉴定结果

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1.1“金花”菌的形态学特征

从渥堆六堡茶中分离纯化得到4 株“金花”菌，分别命名为LB-22、LB-32、LB-35、LB-55。采用三点法将4 株“金花”菌接种到CA培养基上生长7 d，如图1所示，LB-35在CA培养基上生长最快；LB-22菌落质地紧密，较平整，圆形绒状，整体呈金黄色泛绿，中间部位颜色较浅；菌落背面光滑，颜色同正面；LB-32质地密集，正面中心灰绿色，外围浅绿色，边沿浅杏色，圆形，背面光滑，有黄色闭囊壳；LB-35菌落质地紧密，圆形有脊，呈放射状，正面背面金色，边沿颜色较浅；LB-55菌落质地紧密，圆形，正面同背面，金黄色，中心颜色稍深，黄色闭囊壳丰富。根据形态学观察结合光学显微镜观察结果，初步将LB-22鉴定为青霉属，LB-32、LB-35和LB-55鉴定为曲霉属。

1.2“金花”菌的分子生物学鉴定

将菌株测序所得序列与NCBI数据库进行比对，构建系统发育树，如图2所示。结合表1可知，菌株LB-22为芒果青霉（P.manginii）、LB-32为赤曲霉（A.ruber）、LB-35为间型曲霉（A.intermedius）、LB-55为阿姆斯特丹曲霉（A.amstelodami）。

2 4 株“金花”菌发酵对六堡茶感官品质的影响

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从表2可知，4 株“金花”菌对六堡毛茶发酵均有很大影响，发酵28 d后，在外形、汤色、香气和滋味上都有明显改变。未加菌CK干茶外形乌褐油润，开汤后香气纯正、生晒味，汤色橙黄、清澈明亮，滋味浓强、苦涩，叶底绿褐，与毛茶感官品质接近，说明在无菌状态下仅有湿热作用，对六堡茶感官品质影响不大。4 株“金花”菌发酵的茶样中，LB-22和LB-35发酵六堡茶外形无金花，LB-32和LB-55发酵茶样表面布满金花，说明“金花”菌需要特定的发酵环境中才能产金黄色闭囊壳。4 种发酵茶样在香气方面差异显著，LB-22发酵茶样菌香带花香；LB-32发酵茶样木香；LB-35发酵茶样木质香带甜香、清花香；LB-55发酵茶样板栗香带甜花香。4 种发酵茶样的汤色都有显著改善，尤其是LB-32发酵茶样汤色红浓、清澈。在滋味上，LB-35发酵茶样滋味醇厚顺滑、带甜；LB-55发酵茶样醇滑带甜；LB-32醇和顺滑，有陈味；LB-22发酵茶样醇和，稍带收敛性，带腥味。叶底上，4 种发酵茶样均较柔软，色泽无明显差异。总体而言，接种LB-35的茶样香气更突出，滋味更醇厚。

3 4 株“金花”菌发酵六堡茶生化成分的变化

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3.1 茶多酚、没食子酸及儿茶素的变化

从表3可知，与CK相比，在4 株“金花”菌作用下，茶多酚含量呈极显著下降趋势（P＜0.01），LB-22、LB-32、LB-35和LB-55发酵组分别降低了37.47%、47.98%、40.02%、23.04%。值得注意的是，对比CK，除茶黄素含量无显著性变化外，其余各发酵组茶褐素含量均极显著升高（P＜0.01），而茶红素含量均极显著降低（P＜0.01）。4 株“金花”菌发酵均能将茶多酚主要转化为茶褐素，尤其是LB-35发酵样，茶褐素质量分数达（13.14±0.13）%。

与CK相比，LB-22、LB-35和LB-55发酵组的没食子酸（GA）含量极显著降低（P＜0.01），LB-22、LB-35分别降低了89.26%、94.63%，LB-55发酵组几乎检测不到，LB-32组GA含量极显著升高（P＜0.01），达（8.39±0.05）mg/g。

与CK相比，LB-22、LB-32、LB-35和LB-55发酵组的酯型儿茶素含量均极显著下降（P＜0.01），其中EGCG含量分别降低了79.91%、86.04%、91.13%、92.84%，使得茶汤苦涩味转化为醇厚。GCG含量分别降低了71.60%、84.45%、88.91%、92.80%，ECG含量分别降低了76.90%、83.01%、88.06%、87.75%；CG含量分别降低了40.07%、98.37%、96.74%、62.21%。而4 株“金花”菌发酵六堡茶的非酯型儿茶素中，除EC含量均下降外，GC、EGC、C含量的变化趋势各有不同。与CK相比，LB-32发酵六堡茶的GC含量上升了10.08%（P＜0.01），LB-22、LB-35、LB-55分别降低了46.46%（P＜0.01）、65.91%（P＜0.01）、13.45%（P＜0.01）；LB-22发酵六堡茶的EGC含量上升了72.59%（P＜0.01），LB-32、LB-35、LB-55分别降低了2.63%、70.26%（P＜0.01）、36.18%（P＜0.01）；LB-22和LB-55发酵六堡茶的C含量较CK组分别上升了44.00%（P＜0.01）和51.56%（P＜0.01），LB-32和LB-35的C含量较CK组分别降低了23.33%和65.33%（P＜0.01）。4 株“金花”菌发酵六堡茶的总儿茶素均极显著降低（P＜0.01），分别降低了44.30%、68.00%、84.61%、73.31%。以上结果表明，虽然4 株“金花”菌发酵六堡茶各儿茶素类组分含量的变化趋势不同，但总儿茶素和酯型儿茶素的含量极显著下降（P＜0.01），减轻了六堡毛茶的苦涩味和刺激性。

3.2 水浸出物、游离氨基酸含量的变化

由表3可知，与未接菌CK相比，六堡毛茶经不同“金花”菌发酵28 d后，茶叶中水浸出物含量变化也各不相同，LB-22与LB-32发酵茶样水浸出物含量显著下降（P＜0.05），而LB-35和LB-55样含量显著上升（P＜0.05），接种LB-55发酵的六堡茶水浸出物质量分数达到39.77%，明显高于其他3 株“金花”菌发酵的六堡茶，结合感官审评结果（表2）可知，LB-55发酵的六堡茶茶汤滋味醇厚。

由表3可知，与CK相比，在4 株“金花”菌作用下，游离氨基酸含量呈极显著下降趋势（P＜0.01），下降幅度最大的是LB-32。造成氨基酸含量下降的原因可能是“金花”菌生长过程中利用氨基酸作为生长氮源，同时在酶促作用下产生脱氨作用和脱羧作用，将氨基酸转化为挥发性或非挥发性芳香物质。

3.3 咖啡碱含量的变化

由表3可知，与CK相比，4 株“金花”菌发酵六堡茶的咖啡碱含量变化各异，LB-32和LB-55发酵六堡茶咖啡碱含量呈极显著增加趋势（P＜0.01），LB-55发酵茶样中咖啡碱含量达（53.74±0.06）mg/g，LB-22和LB-35发酵组呈下降趋势。据报道，咖啡碱在六堡茶成品茶中的含量一般为28.30～29.30 mg/kg。研究表明，霉菌类可以提高后发酵过程中茶叶的咖啡碱含量。

3.4 黄酮和可溶性糖含量的变化

由表3可知，与CK相比，在4 株“金花”菌作用下，总黄酮含量极显著下降（P＜0.01），但4 种发酵茶之间差异不显著。

由表3可知，与CK相比，LB-22、LB-32和LB-35发酵组可溶性糖含量呈极显著下降趋势（P＜0.01），其原因可能是发酵菌种生长繁殖时需要大量的可溶性糖作为碳源和能量来源，另外糖类物质在微生物发酵作用下，与儿茶素生成糖苷化儿茶素，也可能导致茶中可溶性糖含量降低[35]；LB-55发酵组可溶性糖含量呈极显著增加趋势（P＜0.01），结合感官审评结果（表2）可知，LB-55茶样在滋味审评中带甜味。

3.5 PCA

如图3所示，4 株“金花”菌发酵六堡茶和CK差异显著。PCA将5 个处理组划分为2 组，组1包括CK组，组2包括LB-22、LB-32、LB-35、LB-55组，PC1和PC2分别解释总方差的49.53%和19.78%，CK与4 株“金花”菌发酵茶样相比，在PC1上被区分；LB-22和LB-32与LB-35和LB-55发酵样品在PC2上被区分，表明不同“金花”菌发酵对六堡茶品质成分影响各异。茶黄素、GCG、ECG、EGCG和总儿茶素分别是PC1的前5 位贡献物质，水浸出物、EGC、茶红素、黄酮和GA是PC2的前5 位贡献物质。此外，HCA表明这些化学成分也聚为两簇，茶褐素和水浸出物聚为一簇，其他17 种化合物聚为另一簇。

结 论

从广西六堡茶渥堆过程的茶样中分离出4 株“金花”菌，通过菌落形态、光学显微镜特征和分子生物学鉴定绘制系统发育树，4 株“金花”菌分别鉴定为LB-22 P.manginii、LB-32 A.ruber、LB-35 A.intermedius和LB-55 A.amstelodami。其中，A.ruber和A.amstelodami是六堡茶渥堆及陈化过程中曾报道过的“金花”菌，而P.manginii和A.intermedius与以往所报道的六堡茶“金花”菌不同，曾出现于茯砖茶和普洱茶中，对茶叶品质成分转化有重要影响，P.manginii为“金花”普洱茶中曾报道过的优势菌，Zhou Binxing等通过对比贮藏过程中“金花”普洱茶和普洱茶的化学成分和真菌群落，发现P.manginii与可溶性糖含量呈极显著正相关（P＜0.01）。

为探索4 株“金花”菌固态发酵对六堡茶品质的影响，分别通过感官审评和HPLC法，分析测定了4 种“金花”菌发酵六堡茶中的感官品质及主要化学成分，包括水浸出物、可溶性糖、游离氨基酸、茶多酚、3 种茶色素、8 种儿茶素类物质、总黄酮类化合物、GA和咖啡碱含量。PCA和HCA揭示了4 株“金花”菌发酵与CK之间的差异。特别是通过PCA，LB-22、LB-32、LB-35和LB-55发酵六堡茶聚为一组，与CK表现出明显差异。六堡毛茶经过4 株“金花”菌发酵后，总黄酮、总游离氨基酸、茶多酚、茶红素、儿茶素类（EC、CG、C、EGCG、GCG、ECG）和总儿茶素含量极显著降低（P＜0.01），而茶褐素含量极显著升高（P＜0.01），结合感官审评结果，4 株“金花”菌发酵均能明显改善六堡茶品质，使毛茶的品质在相对较短的时间接近成品茶，即汤色由橙黄转为红浓、红棕，增加了陈香、木质香、菌花香，滋味由浓强苦涩转为醇厚顺滑。4 株“金花”菌发酵六堡茶感官品质各有不同，增添了六堡茶新的风味，特别是LB-35 A.intermediu发酵的六堡茶滋味醇厚顺滑带甜，木质香带甜花香，汤色红棕明亮，可作为六堡茶发酵优势菌种应用于生产。本研究结果有助于六堡茶“金花”菌的开发和利用，可为六堡茶产业化研究、产品定向开发提供理论依据。

本文《“金花”菌的鉴定及接种发酵六堡茶的品质变化》来源于《食品科学》2023年44卷第22期243-249页，作者：吴新惠，杜金杰，刘晓纯，廖楷滨，覃玉娜，张瑜容，张灵枝，龙志荣，邱瑞瑾*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221206-053 。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。

实习编辑：北京化工大学 王小云；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。

图片来源于文章原文及摄图网。

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