通过过度表达，增强马克斯克鲁维酵母对玉米芯的同步糖化和共发酵

木质纤维素生物质 (LCB) 主要由纤维素 (35–50%)、半纤维素 (20–35%) 和木质素 (10–25%) 组成，是一种来源丰富、前景广阔的可再生、可持续资源，已成为能源和化学品生产的重要生物质原料。

玉米芯约占玉米农作物废弃物的 30%，与其他生物质原料相比，具有高密度、均匀性以及低硫、氮含量等多种优势。此外，玉米芯可以在玉米粒收获期间收集。利用玉米芯代替粮食发酵生产生物乙醇，具有重要的经济效益和社会效益。

在处理过程中，为了使用酶有效水解 LCB，需要进行预处理破坏晶体结构并去除木质素。然而，在预处理过程中，会产生抑制剂，包括弱酸、呋喃和酚类化合物。这些化合物会抑制微生物生长和发酵。解决这一问题的策略包括将抑制剂修改为毒性较小的形式或将其与木质纤维素水解产物分离。然而，排毒往往会导致糖分流失。

使用具有高抑制剂抗性的基因工程发酵微生物，可以直接使用非解毒底物。基于此可以开发更具可行性的策略。

由 LCB 生产乙醇通常采用同步糖化发酵 (SSF) ，这种方法消除了最终产物抑制、减少了酶的使用、缩短了加工时间并降低了运营成本。并且，通过 SSF 可以实现高固体负载的高滴度乙醇生产。

然而，在大多数情况下，预处理过程中产生的水解产物，包括木糖（水解产物中的主要糖成分），不会被使用，因为其中含有大量的 LCB 衍生的抑制剂。因此，设法实现 LCB 中的葡萄糖和木糖的同时糖化和共发酵 (SSCF)， 对于提高经济可行性至关重要，其面临的障碍是水解产物中的 LCB 衍生抑制剂。

马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）生长速率高（40℃ 条件下为 0.86–0.99h-1），具有耐热性并能够利用戊糖。这种酵母能够进行高温发酵，因此减少了污染处理和冷却成本，便于在夏季和热带地区应用，并提高了 LCB 的 SSF（SSCF）。马克斯克鲁维酵母对单一类型抑制剂的耐受性往往高于酿酒酵母，但其对抑制剂的耐受性仍需提高。

（来源：Bioresource Technology）

近日，在Bioresource Technology上发表了题为“Enhancing simultaneous saccharification and co-fermentation of corncob by Kluyveromyces marxianus through overexpression of putative transcription regulator”的研究论文，研究人员发现马克斯克鲁维酵母中功能未知的基因（KMAR_80012）的过度表达显著提高了对木质纤维素衍生抑制剂的耐受性。基于此进行鉴定，结果显示，该基因的破坏和过度表达分别降低和增强了马克斯克鲁维酵母对 LCB 衍生抑制剂和其他应激源的耐受性。

（来源：Bioresource Technology）

根据研究论文，研究人员使用 RT-PCR 测量混合抑制剂、酚类化合物、乙酸或呋喃化合物存在下KMAR_80012（本研究中的KmMSR）的表达。结果显示，与不存在抑制剂相比，在混合抑制剂、酚类化合物、乙酸或呋喃化合物存在下，KmMSR的表达分别显著上调 245.72±10.23、21.55±4.30、170.99±13.01 和 1656.87±142.28 倍。证明了KmMSR的破坏或过度表达会降低或提高马克斯克鲁维酵母对抑制剂的耐受性。

除了抑制剂之外，在使用 LCB 作为底物的发酵过程中还会出现对乙醇、温度以及高浓度 NaCl 和葡萄糖的耐受性。因此，研究人员评估了 KmMSR 对这些压力源的影响。测试条件包括分别向培养基中添加 20 g/L 乙醇、0.5 M NaCl、180 g/L 葡萄糖，以及将培养温度提升至 45℃，结果显示，KMAR_80012的破坏或过度表达会降低或增强其对各种胁迫的耐受性，表明它可用于构建 LCB 利用菌株。KMAR_80012被指定为KmMSR，表示马克斯克鲁维酵母多重应激抗性。

为了确定KmMsr的功能，利用 AlphaFold2 预测了KMAR_80012的结构。KMAR_80012 在其 N 末端包含一个位于 GAL4 样 Zn(II)2Cys6 双核簇 DNA 结合结构域两侧的柔性区域，并且位于细胞核中。具有富含 100 至 150 个氨基酸之间的氨基酸残基 G 和 S 的灵活区域。

Zn(II)2Cys6 锌指转录因子与多种生理过程相关。目前尚未见有关 Zn(II)2Cys6 锌指转录因子与多种应激耐受相关的报道。转录因子通过 DNA 结合域结合到特定的基因组位置来调节基因表达。

研究人员构建了一系列柔性区缺失突变体来评估它们对抑制剂耐受性的影响。结果显示，柔性区缺失的KmMSR表达增强了对抑制剂的耐受性，其中 130-150 个氨基酸缺失的KmMSR（KmMSR-130-150aaΔ）表达对抑制剂产生了最高的耐受性。

研究人员评估了在多种抑制剂存在下 YKmMSR-130-150aaΔ 的乙醇发酵，结果显示，乙醇产量和生产率分别增加了 36.31% 和 80.22%。在发酵过程中，测定抑制剂浓度的变化。通常来说，使用各种脱氢酶或还原酶将抑制剂转化为毒性较小的化合物也是酵母抵抗 LCB 衍生的抑制剂的策略之一。不过，结果表明，KmMsr不会通过增强抑制剂的降解或转化来影响对抑制剂的耐受性。

此外，KmMSR-130-150aaΔ 的过表达增强了玉米芯在高温下的同步糖化和共发酵。使用构建的菌株 YKmMSR-130-150aaΔ 以不进行解毒的玉米芯同步糖化共发酵，在 37℃ 和 42℃ 下分别产生 40.01±1.04 g/L 和 38.86±2.09 g/L 乙醇，分别是对照菌株产生的乙醇的 2 倍和 5 倍。

综合来看，抑制剂降解和转录组分析将马克斯克鲁维酵母多重应激抗性 (KmMSR) 基因与酵母细胞的稳健性联系起来。去除柔性区域的突变体的过度表达进一步增强了马克斯克鲁维酵母对抑制剂的耐受性。YKmMSR-130-150aaΔ 可以被认为是高温下 LCB 生产生物乙醇的绝佳菌株选择。这些结果为提高乙醇耐受性和实际工业生物燃料生产的产量提供了基础。

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