FSHW | 成都大学“系统食品学”创新团队：根皮苷与胃蛋白酶和胰蛋白酶结合亲和力及抗氧化活性的评价

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Introduction

食用水果有益于健康，可以减少疾病的风险。其中，水果类黄酮已被证明对增强健康有益。随着消费水平的提高，人们更加关注食品对其健康的影响。消费趋势已转向具有高营养和保健功能的功能食品。含有生物活性化合物的功能食品的数量和种类逐渐增多。苹果是人们日常生活中常见的一种水果，它含有多种黄酮类化合物。在食品和饮料中添加苹果类黄酮可以提高食品的营养价值，如功能性凝胶甜点、零食棒、酸奶等。

根皮苷（PHL）是药食同源的二氢查尔酮类黄酮之一，主要存在于苹果和多穗柯甜茶等组织的嫩叶、根茎和苹果果中。PHL具有多种促进健康的作用，包括保护心血管、抗病毒、抗氧化活性和抗糖尿病活性。多项研究发现，PHL可以抑制小肠上皮粘膜上的钠-葡萄糖转运蛋白系统（SGLT1），以及通过改善胰岛素敏感性和葡萄糖摄取来阻止肠道葡萄糖的吸收。此外，PHL对酪氨酸酶有良好的抑制作用，可预防一些皮肤病。

当黄酮类化合物被生物体摄入时，它们可能与消化酶发生作用，影响营养物质的消化和吸收。黄酮类化合物的抗氧化活性也可能改变。众所周知，抗氧化剂与身体健康密切相关，研究黄酮类化合物的抗氧化活性具有重要意义。胃蛋白酶和胰蛋白酶是主要的消化性蛋白酶。胃蛋白酶是一种天冬氨酸蛋白酶，其分子质量为35 kDa。它经常被用于消化模型中，以揭示生物化合物对其结构构象的影响。胃蛋白酶与芦丁等黄酮类化合物的相互作用已被广泛地研究。其中，芦荟大黄素与胃蛋白酶的结合降低了其抗氧化活性。胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，相对分子质量约为24kDa，有三个催化活性位点His-57、Asp-102和Ser-195。它由胰腺分泌，是自然界中最丰富的蛋白酶，由无活性的胰蛋白酶原转化而成。此外，胰蛋白酶是一种触发酶，能激发消化系统中的多种消化酶，对食物蛋白质的消化有着重要的影响。PHL在消化过程中很可能与胃蛋白酶和胰蛋白酶结合，目前有关PHL与消化酶相互作用的研究还有所欠缺，因此研究PHL与胃蛋白酶和胰蛋白酶的结合作用和抗氧化活性变化是非常必要的。

成都大学食品与生物工程学院张静硕士、吴笛特聘研究员等在本文以PHL与胃蛋白酶和胰蛋白酶为研究对象，通过计算机模拟预测了其结合模式；测定了淬灭类型和构象变化，计算了热力学参数；通过抗氧化活性研究了PHL与蛋白酶结合后的抗氧化能力的变化；比较评估了PHL与胃蛋白酶和胰蛋白酶的相互作用机制。

Results and discussion

分子对接

选择了最佳的结合能量构象进行研究。如图所示，PHL被Gly-217, Asp-32, Thr-77, Met-289, Pro-292, Ile-73, Ser-35, Asp-215, Gly-34, Tyr-75, Tyr-189, Thr-218的氨基酸残基包围。PHL与胃蛋白酶的催化活性氨基酸残基Asp-32和Asp-215结合，占据了蛋白酶的腔体。此外，Thr、Ser、Tyr、Ile和其他氨基酸都是疏水性氨基酸残基，因此，PHL与胃蛋白酶相互作用时可能存在范德华力。PHL和胃蛋白酶残基Gly-76（3.22 Å）和Ile-128（2.98 Å）之间也存在氢键。PHL被Gly-219, Trp-215, Asp-189, Tyr-228, Ser-214, Gly-226, Val-213, Gly-216, Ser-190, Val-227, Leu-99, Thr-98, Gln-192, Gln-192, Ser-195等氨基酸残基包围。Asn-97（2.89 Å）通过氢键连接到PHL上，这增加了PHL与胰蛋白酶的结合亲和力。总之，氢键、范德华力和静电作用力主要参与了PHL与蛋白酶的结合。

1 PHL与胃蛋白酶（A,B）/胰蛋白酶（C,D）的分子对接图

分子动力学模拟

游离胃蛋白酶的RMSD值为1.99Å低于PHL与胃蛋白酶体系2.69 Å。PHL与胰蛋白酶体系的RMSD值（1.89 Å）高于单独胰蛋白酶（1.46 Å），表明PHL与蛋白酶结合后影响蛋白酶的稳定性。单独胃蛋白酶与PHL和胃蛋白酶体系的平均Rg值分别为19.74Å和20.42Å；胰蛋白酶的Rg值基本上没有变化（16.39Å和16.83Å）。总的来说，蛋白酶的Rg值几乎保持不变，PHL不影响蛋白质的紧密性。单独胃蛋白酶/胰蛋白酶的RMSF值略低于PHL和胃蛋白酶/胰蛋白酶体系。PHL与胃蛋白酶/胰蛋白酶结合后两种蛋白酶的β-折叠含量均下降。

图2 PHL与胃蛋白酶/胰蛋白酶的RMSD (A, B)、Rg (C, D) 和 RMSF (E, F)

荧光猝灭

胃蛋白酶/胰蛋白酶具有约340 nm的强吸收荧光峰。同时，随着PHL浓度的增加，两种蛋白酶的荧光强度逐渐减弱。时间分辨荧光可以有效地判断静态和动态荧光猝灭。单独蛋白酶与PHL和胃蛋白酶/胰蛋白酶复合体系的τ值接近，表明PHL与蛋白酶的结合是静态猝灭。

记录不同温度下PHL与胃蛋白酶/胰蛋白酶体系的结合参数和热力学参数。其中n接近于1，表明PHL通过一个活性结合位点与蛋白酶结合。PHL与胃蛋白酶之间的Ka值为105 L/mol，表明PHL与蛋白酶形成的复合物的结合亲和力适中。ΔGo的值为负值，表明PHL与胃蛋白酶/胰蛋白酶的结合是自发放热。当PHL与胃蛋白酶结合时，ΔHo< 0和ΔSo< 0 (-34.480 kJ mol-1 and -45.612 J/mol·K)表明范德华力和氢键是结合过程中的主要结合力。当PHL与胰蛋白酶结合时，ΔHo< 0和ΔSo> 0 (-25.024 kJ/ mol and 6.206 J/mol·K)，表明PHL与胰蛋白酶相互作用的作用力主要是静电相互作用力。

图3 PHL与胃蛋白酶/胰蛋白酶结合的荧光光谱(A,B)PHL存在和不存在时胃蛋白酶/胰蛋白酶的时间分辨荧光衰减曲线（C,D）

构象变化

根据同步荧光光谱发现，随着根皮苷浓度的增加，胃蛋白酶/胰蛋白酶的酪氨酸的峰位置基本不变，而色氨酸的峰位置分别为蓝移和红移。表明PHL与胃蛋白酶的结合导致色氨酸的极性降低，疏水性增强。胰蛋白酶的变化与此相反。通过圆二色光谱发现，游离胃蛋白酶在200 nm处有一个负峰，是一个无规卷曲的特征峰，说明胃蛋白酶的结构中有许多β-折叠和无规卷曲。游离胰蛋白酶在209 nm处有一个峰。添加PHL后，峰值强度略有变化，但峰值位置没有变化，说明胰蛋白酶的结构仍以β-折叠为主。通过红外光谱评估结合后蛋白酶的构象变化。蛋白质的酰胺I带（1 500~1 600 cm-1）主要是C=O拉伸，酰胺II带（1 600~1 700 cm-1）则主要是C-N拉伸和N-H弯曲。存在和不存在PHL的胃蛋白酶/胰蛋白酶有两个吸收峰。总的来说，PHL的添加对蛋白酶的结构有轻微影响，但蛋白酶的主要结构没有被破坏。

图4 不同浓度的PHL与胃蛋白酶/胰蛋白酶的同步荧光光谱、圆二色光谱图、红外光谱图

抗氧化活性

用ABTS和FRAP方法测定PHL的抗氧化能力。PHL有较好的ABTS清除率和FRAP还原能力，抗氧化能力与其浓度呈显著的数量效应关系。PHL和胰蛋白酶的ABTS清除率高于单独的PHL（P < 0.05）。PHL与胃蛋白酶结合后，ABTS清除率显著降低（P < 0.05）。FRAP法测定抗氧化能力的结果与ABTS法相似。

图5 PHL和PHL与胃蛋白酶/胰蛋白酶复合体系的ABTS清除率（A）和还原能力（B）。图中不同的字母（a-c）表示显著性差异（P < 0.05）

Conclusion

比较分析了PHL与胃蛋白酶/胰蛋白酶的结合方式和抗氧化性变化。PHL与胃蛋白酶/胰蛋白酶的结合是自发的。同步荧光结果显示，PHL与胃蛋白酶作用后色氨酸的极性下降，而PHL与胰蛋白酶结合后色氨酸的极性增强。圆二色光谱和红外光谱结果证明了PHL与胃蛋白酶/胰蛋白酶结合后蛋白酶的构象变化。此外，还为PHL与胃蛋白酶/胰蛋白酶结合后的抗氧化活性变化提供了解释。PHL与胰蛋白酶的结合比胃蛋白酶更容易、更牢固，这可能有利于PHL的消化和吸收。本研究中的所有实验都是在体外进行的，其结果为PHL的体内研究提供了参考。

作者简介

第一作者简介

张静，女，成都大学食品与生物工程学院，食品加工与安全2020级硕士研究生，研究方向为食品组分互作与营养递送。

通信作者简介

吴笛，成都大学特聘研究员，硕士生导师，加拿大多伦多大学访问学者。主要从事食品组分互作、营养递送、及光调控生物大分子结构及功能的策略研究。近年来，主持国家自然科学基金青年基金1项，四川省科技厅应用基础面上项目1项，其它省部及厅局级项目4项，参与国家自科基金及四川省重大科技成果转化分析测试平台建设项目3项。公开发表国内外学术论文50余篇，其中第一通讯作者发表中科院TOP论文23篇，申报中国发明专利2项。担任Food Chemistry、Carbohydrate Polymers 、Food Hydrocolloids、Toxicology in Vitro、Food Bioscience等多SCI期刊审稿人。指导学科竞赛获国家级、省部级奖多项，获拔尖创新人才培养荣誉学业导师称号，参编专著1部。

Evaluation of the binding affinity and antioxidant activity of phlorizin to pepsin and trypsin

Jing Zhanga, Lan Tanga, Xia Hua, Zhen Zenga, Wen Wua, Fang Genga, Hui Lib, Di Wua,*

a Meat Processing Key Laboratory of Sichuan Province, School of Food and Biological Engineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China

b School of Chemical Engineering, Sichuan University, Chengdu 610065, China

*Corresponding author.

Abstract

Phlorizin (PHL) is a natural compound with strong antioxidant properties mainly found in apples. In this paper, the interaction mechanism of PHL with pepsin and trypsin was comparatively evaluated by computer simulation, fluorescence spectra, circular dichroism (CD), and Fourier transform infrared (FT-IR) spectra at a molecular level. Fluorescence spectra showed that PHL quenches the pepsin/trypsin by static quenching. Thermodynamic parameters indicated that PHL binds to pepsin mainly through hydrogen bonds and van der Waals forces, and that of trypsin was electrostatic forces. The ground state complexes PHL and protease have a moderate affinity of 105 L/mol PHL binds more strongly to trypsin than to pepsin. CD and FT-IR spectra results showed that pepsin/trypsin decreased the β-sheet content and slightly changed its secondary structure upon PHL. These experimental results are mutually verified with the predicted computer-aid simulation results. Upon PHL and trypsin binding, the antioxidant capacity of PHL was elevated. Nevertheless, the antioxidant capacity of PHL was decreased after binding to pepsin. This work elucidates the binding of PHL binding mechanisms to pepsin/trypsin and provides useful information for the digestion of PHL to improve the application of PHL in food processing.

Reference:

ZHANG J, TANG L, HU X, et al. Evaluation of the binding affinity and antioxidant activity of phlorizin to pepsin and trypsin [J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(1): 392-400. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250033.

文章编译内容由作者提供

编辑：王佳红；责任编辑：张睿梅

封面图片来源：图虫创意