《食品科学》：宁夏大学罗玉龙博士等：宰后成熟过程中脂多糖诱导剂对滩羊肌细胞线粒体凋亡信号通路的影响

线粒体作为细胞凋亡的中枢调控者，参与调控细胞氧化还原状态变化过程和能量供应，同时对肌细胞凋亡进程起着极其重要的调控作用。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌外膜的主要成分，可以和TLR4基因编码的跨膜蛋白Toll样受体4（TLR4）结合。LPS可诱导细胞凋亡的发生，但对于LPS诱导细胞凋亡对线粒体凋亡通路的影响鲜有研究。

宁夏大学食品科学与工程学院的李 荣、罗瑞明，罗 玉龙*等人以滩羊背最长肌为研究对象，通过LPS诱导凋亡，测定其在4 ℃成熟0、6、12、24、72 h过程中滩羊肉细胞凋亡率、凋亡酶活力、线粒体ATP含量、琥珀酸脱氢酶（SDH）和柠檬酸合酶（CS）活力，采用酶联免疫吸附测试（ELISA）试剂盒测定Bcl-2家族蛋白含量，采用Western blot法测定细胞凋亡因子Cyt-c和Caspase-3的表达量，以此阐释滩羊肉成熟过程中LPS诱导凋亡与线粒体凋亡途径的关系，以期为后续揭示LPS诱导凋亡的机制提供思路，并为冷却滩羊肉贮藏期间肉品质量控制技术研发提供一定的理论参考。

1 宰后成熟过程中pH值变化

宰后肌肉pH值的下降会造成内环境的酸化，从而影响肌肉保水性，是衡量宰后初期肉品质的重要指标之一。从图1可以得出，宰后0～72 h内，对照组的pH值显著下降了5%（P＜0.05）；12～24 h内对照组pH值显著高于LPS处理组（P＜0.05）。LPS处理组在0～24 h内呈现显著下降趋势（P＜0.05），并在24 h达到极限pH值，随后开始上升。

2 宰后成熟过程中细胞凋亡率的变化

由图2可知，绿色荧光的细胞核为TUNEL阳性细胞核。随着宰后成熟时间的延长，TUNEL阳性细胞核数量呈现增多的趋势，且同一成熟时间LPS处理组的TUNEL阳性细胞核数量多于对照组。可见LPS会诱导细胞凋亡。如图3所示，宰后成熟过程中，细胞凋亡率整体呈显著上升的趋势（P＜0.05）；0～72 h，对照组和LPS处理组细胞凋亡率分别上升至31.70%和42.47%；成熟期间对照组细胞凋亡率均显著低于LPS处理组（P＜0.05），表明LPS处理滩羊促进了细胞凋亡进程，对细胞凋亡具有诱导作用。

3 宰后成熟过程中细胞凋亡酶活力的变化

线粒体凋亡通路中，Caspae-9和Caspae-3作为重要的效应酶，与凋亡的发生密切相关。由图4A可知，LPS处理组Caspase-9活力在0～12 h显著上升并达到最大值1.413，随后显著下降（P＜0.05）；6～12 h内对照组Caspase-9活力显著上升并在12 h达到最大值1.306；0～72 h，LPS处理组Caspase-9活力均显著高于对照组（P＜0.05）。如图4B所示，对照组Caspase-3活力在宰后成熟过程中显著上升（P＜0.05），并于24 h达到最大值，随后呈现显著下降趋势（P＜0.05）；0～72 h内，LPS处理组Caspase-3活力呈先升后降趋势，并于24 h达到最大值；0～72 h内，LPS处理组Caspase-3活力均显著高于对照组（P＜0.05）。

4 宰后成熟过程中Cyt-c的氧化还原状态的变化

研究表明Cyt-c的氧化还原状态对于细胞凋亡的启动具有重要影响。只有氧化型Cyt-c能够激活Caspase，还原型Cyt-c没有启动细胞凋亡的作用。图5反映了宰后滩羊肉成熟过程中Cyt-c氧化还原状态变化，宰后0～72 h，对照组和LPS处理组中Cyt-c还原水平显著降低（P＜0.05）。LPS处理组的下降速度较对照组更快。Cyt-c还原水平的下降表明Cyt-c氧化水平升高，由此介导细胞凋亡发生。

5 宰后成熟过程中线粒体ATP含量的变化

滩羊宰后细胞内环境改变，阻断了氧气进入，缺氧使线粒体的氧化还原电位降低，造成呼吸链功能紊乱，ATP不能正常合成，磷酸原体系中的肌酸磷酸也会在很短的时间内被耗尽，无氧酵解途径开启，最终产生大量的乳酸。由图6可知，线粒体ATP含量在宰后成熟过程中整体呈现显著下降的趋势（P＜0.05）；0～72 h内，对照组ATP含量显著降低了47.34%，LPS处理组的ATP含量显著下降了56.02%，LPS处理组ATP含量显著低于对照组（P＜0.05），这可能是LPS加快了细胞从有氧呼吸向无氧糖酵解的进程。

6 宰后成熟过程中线粒体标志酶活力的变化

由图7A可知，成熟早期（0～6 h），LPS处理组SDH活力均显著低于对照组（P＜0.05），呈显著上升趋势（P＜0.05）；随后6～72 h呈显著下降趋势，可能是因为LPS处理加剧了线粒体能量的消耗，从而引起SDH活力短暂升高。如图7B所示，LPS处理组CS活力在0～6、12～72 h内呈现显著下降趋势（P＜0.05），6～12 h内呈显著上升趋势（P＜0.05）；对照组CS活力在0～12、24～72 h内呈显著下降趋势（P＜0.05），12～24 h显著上升趋势（P＜0.05）。

7 宰后成熟过程中Bcl-2家族蛋白水平的变化

Bax和Bcl-2都属于Bcl-2蛋白家族，通过调节线粒体膜通透性参与线粒体凋亡途径并发挥关键作用。成熟期间Bax水平的变化如图8A所示，在宰后成熟过程中，Bax水平整体呈现先上升后下降趋势，6 h为最高值。这与Ma Jibing等在牛肉宰后成熟期间观察到Bax的水平呈现先上升后下降的趋势结果一致。成熟期间Bcl-2水平的变化如图8B所示，在宰后成熟期间Bcl-2水平整体呈现显著下降的趋势（P＜0.05）；其中LPS处理组水平显著低于对照组（P＜0.05）。

如图9所示，在宰后成熟过程中，LPS处理组的Bax/Bcl-2显著高于对照组（P＜0.05），表明促凋亡能力更强。综上说明，LPS可以调控Bcl-2家族蛋白含量，诱导凋亡的发生。

8 宰后成熟过程中线粒体信号通路关键因子释放的情况

由图10、11可知，在宰后成熟过程中，LPS处理组的胞浆Cyt-c表达量在宰后12 h显著升高，24～72 h内LPS处理组胞浆Cyt-c表达量呈下降趋势。这是由于宰后前期Cyt-c大量释放，而随着线粒体损伤的加重，Cyt-c的合成量不断减少，且一部分Cyt-c与Apaf-1结合，最终导致Cyt-c含量在宰后24 h后逐渐减少。

Caspase-3可以切割细胞骨架蛋白，它的激活标志着细胞凋亡的发生。本实验测定了Caspase-3活化蛋白的相对表达量，以分析LPS处理对宰后细胞凋亡的影响。Caspase-3酶原本身并没有诱导凋亡的活性，只有裂解为17～20 kDa的活化片段才能参与诱导细胞凋亡。

图12为不同处理组分别成熟0、6、12、24、72 h后Caspase-3的免疫印迹图谱，可以看出，经过LPS处理后，滩羊肉骨骼肌中Caspase-3活化片段的灰度均高于对照组。这说明在凋亡诱导剂LPS处理加快了Caspase-3酶原被激活并降解成活性片段的速度，故LPS是通过加速Caspase-3酶原的激活促进细胞凋亡。对活化片段进行光密度值的定量分析，结果如图13所示。LPS处理组的Caspase-3活化片段蛋白相对含量始终高于对照组，表明LPS处理组滩羊肉中Caspase-3裂解成活性片段的程度强于对照组，因此，LPS处理有利于加速宰后Caspase-3的激活。

细胞凋亡过程中DNA会发生降解形成碎片化，从而产生大量的黏性3 ’ -OH末端，可通过TUNEL荧光标记，观察绿色荧光变化，以此了解细胞凋亡情况。本研究中，通过观察TUNEL阳性细胞核数量以及计算细胞凋亡率得出，随着成熟时间的延长，细胞凋亡率呈现上升趋势，在同一成熟时间内LPS处理会加快细胞凋亡的进程。Cyt-c介导细胞凋亡通常伴随着线粒体损伤。研究发现Cyt-c氧化还原状态与细胞凋亡的发生密切相关。本研究结果表明，宰后0～72 h，随着宰后时间的延长，Cyt-c还原水平逐渐降低，氧化水平逐渐升高，表明Cyt-c释放介导细胞凋亡发生在宰后早期。Cyt-c在线粒体介导的细胞凋亡途径中发挥核心作用。Caspase-9活力整体呈现先上升后下降的趋势，这可能是由于宰后前期LPS处理影响Cyt-c氧化还原的活性，氧化型Cyt-c含量增多，从而介导Caspase级联反应信号不断放大，致使Caspase-9的活力上升。以上研究说明，LPS通过促进氧化型Cyt-c形成凋亡小体的作用，间接促进Caspase-9和Caspase-3的激活。Caspase-9的活化早于Caspase-3发生。即Caspase-9作为线粒体凋亡通路中凋亡启动酶，能启动下游的效应酶Caspase-3，进而引起线粒体通路细胞凋亡的发生。

本研究中LPS处理组肌肉pH值随成熟时间延长先下降后上升，并在24 h达到极限pH值，这可能是宰后内环境改变切断了与外界的联系，有氧呼吸转变为糖酵解生成乳酸所致。宰后ATP含量整体显著下降，这是因为宰后氧气的阻断导致线粒体中氧化还原电位下降，呼吸电子传递链发生功能障碍，不能正常地通过三羧酸循环合成ATP，细胞由有氧呼吸途径进入无氧酵解途径，导致细胞内ATP的生成量迅速降低。这一能量变化的过程会影响线粒体标志酶——SDH和CS的活性，本研究发现宰后成熟早期处理组SDH活力高于对照组，CS活力在0～12 h随着成熟时间的延长呈现先下降后上升的趋势。宰后成熟过程中Bax含量整体呈现先上升后下降趋势，Bcl-2含量整体呈现下降趋势。Bax和Bcl-2分别是促凋亡和抗凋亡蛋白，研究发现在凋亡条件下，Bax激活后在线粒体外膜积累，并发生寡聚化，从而导致促凋亡因子如Cyt-c的释放。Bax/Bcl-2可用来评估凋亡发生的程度，本研究结果表明，Bax/Bcl-2呈现上升趋势，且LPS处理组显著高于对照组。通过对Cyt-c和Caspase-3活化蛋白表达量的测定，发现LPS处理加快了Cyt-c的释放和Caspase-3活化，对凋亡进程起到促进作用。

综上，宰后成熟过程中LPS 诱导剂是通过激活Caspase-9和Caspase-3活性、降低细胞能量代谢水平进而影响SDH和CS的活性，促使Cyt-c释放，提高Bax/Bcl-2比值，从而诱导细胞通过线粒体信号通路发生凋亡。

作者简介

通信作者：

罗玉龙，博士，讲师，宁夏自治区“青年科技人才”托举工程人选，《肉类研究》青年编委会委员，主要从事宰后肉的品质控制、肉制品加工过程中风味的缓释与预成等领域的研究；曾在《Meat Science》、《Food Research International》、《Journal of the Science of Food and Agriculture》、《Food Science & Nutrition》、《农业工程学报》和《食品科学》等杂志发表文章。近年来，主持1 项国家自然科学基金青年基金项目和2 项省部级项目。

本文《 宰后成熟过程中脂多糖诱导剂对滩羊肌细胞线粒体凋亡信号通路的影响》来源于《食品科学》2023年44卷第19期10-17页，作者：李荣，罗瑞明，杜瑞，罗玉龙，王金霞，张倩，陈雪妍。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230509-073。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。

实习编辑：渤海大学食品科学与工程学院 王雨婷 ；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

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