华南理工团队利用多重工程化策略高效表达GGT

L-茶氨酸是茶叶中存在的一种独特游离氨基酸，属于谷氨酸 γ-乙基酰胺，有甜味。这也是一种生物活性化合物，可以缓解压力反应、提高认知能力、优化睡眠，并可能具有抗氧化、抗炎和心血管保护作用。由于其药理作用，L-茶氨酸常被用于食品和药品行业甚至护肤品行业。

基于微生物底盘细胞生产 L-茶氨酸是一种极具产业化前景的方法。γ-谷氨酰转肽酶（GGT）是催化 γ-谷氨酰基转换的一种酶，这种酶是生物催化合成茶氨酸的一种关键酶。

近日，来自华南理工大学的研究团队通过多种工程化策略提高了 γ-谷氨酰转肽酶活性并利用这种稳定的生物催化剂催化生成了 L-茶氨酸。该团队成功利用串联启动子、串联信号肽以及过表达信号肽酶结合等策略在枯草芽孢杆菌 ATCC6051Δ5 中高效表达和合成了 γ-谷氨酰转肽酶，包括 BsGGT、 BaGGT 和 BlGGT。

研究显示，采用环氧树脂固定后，重组 BlGGT 重复使用 10 次后酶活仍保持在 82.8%，在 4℃ 条件下保存 2 个月后酶活保持在 87.36%。利用重组 BlGGT 连续催化合成 L-茶氨酸，转化率达到了 65.38%。

（来源：Applied Microbiology and Biotechnology）

本研究已发表在Applied Microbiology and Biotechnology上。本文的通讯作者是华南理工大学生物科学与工程学院教授潘力，他的研究方向是合成生物学、基因组编辑技术、组学技术与深度学习、发酵工程、蛋白质/酶工程以及生物催化合成技术。

枯草芽孢杆菌是 γ-谷氨酰转肽酶更为安全有效的宿主细胞，但仍然存在分泌效率低、表达量低等问题，无法满足工业化大规模生产。需要进行优化增加目标蛋白的分泌和积累，比方说优化调控元件，包括启动子、终止子和信号肽等。同时，可能也面临着因使用抗生素标记物导致出现污染的风险。

基于此，该研究团队选择枯草芽孢杆菌 ATCC6051Δ5 作为表达宿主，通过双启动子和双信号肽的创新组合、信号肽酶的过表达以及三类芽孢杆菌 GGT 的结构和性质分析比较，以实现高水平表达 GGT。

他们选择将胞苷脱氨酶（CDD）基因的 P43 和 Pcd 启动子串联连接，增加起始强度。研究表明，使用双启动子 Pcd-P43 的 BlGGT 菌的胞外活性是使用单启动子 P43 的 139.23%，Pcd-P43 的转录强度更高，能有效增强外源蛋白的表达。

然后将枯草芽孢杆菌中最常用的 α-淀粉酶分泌信号肽 SamyQ 与地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌中 GGT 的信号肽（SBlGGT）、（SBaGGT）和（SBsGGT）分别串联起来，试验结果显示，SamyQ-SBsGGT 双信号肽状态下，胞外酶活性最高。与单个启动子控制的单信号肽 SamyQ 相比，SamyQ-SBsGGT状态下，BlGGT 的胞外活性增加了 63.43%。

▲图 | 经多组合策略工程化修饰的枯草芽孢杆菌 6051∆5 高效生产 GGT（来源：上述论文）

接下来，由于 GGT 的分泌受到 I 型信号肽酶的调节，为了提高分泌蛋白信号肽的切割效率，研究团队在宿主细胞中过表达了多种 I 型信号肽酶，包括 SipS、SipU、SipW、SipT 和 SipV。其中，过表达信号肽酶 SipS 使 BlGGT 分泌量增加幅度最高，达到了 12.82%。

完成这些工作之后，研究团队利用构建的枯草芽孢杆菌表达系统比较了三种细菌（地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌）来源的 GGT 表达水平和酶特性。其中，BlGGT 的胞外酶活性最高，BlGGT 和 BsGGT 在 60℃ 时表现出最高活性，而 BaGGT 在 55℃ 时表现出最高的活性。分析结果表明，BlGGT 具有更为良好的表达效率和性能，值得进一步研究。

为了构建非抗生素标记的 BlGGT 并提高其产量，该研究团队设计了一种用非抗生素标记且可稳定表达的质粒生产 BlGGT 的新方法。该团队将 CRISPR/Cas9n-AID 编辑系统引入枯草芽孢杆菌，首先从表达载体中去除了大肠杆菌的复制起点和相应的抗性标记，然后将该质粒转化至枯草芽孢杆菌宿主中，并使用 CRISPR/Cas9n-AID 碱基编辑系统直接编辑并沉默表达质粒中的 Kan 抗性基因，获得了无抗性标记的菌株 430B6-BlGGTΔoriΔAmpΔK。

▲图 | 利用 CRISPR/Cas9n-AID 碱基编辑系统构建枯草芽孢杆菌无标记抗性重组表达质粒的过程（来源：上述论文）

通过不同菌株的对比，在 72 小时，菌株胞外 GGT 活性达到峰值，无抗性标记菌株 430B6-BlGGTΔoriΔAmpΔK 在摇瓶发酵过程中酶活性可达 53.65 U/mL，这表明，研究中开发的非抗性标记质粒可有效表达 GGT，且效率与传统抗性标记质粒相当。

最后，为了获得稳定的茶氨酸合成生物催化剂，研究团队使用带有环氧基团的树脂载体来固定 BlGGT 酶。优化固定条件后，固定化效率提高了 2.05 倍，最终固定化率为 68.85%，酶活性为 3.15 U/g。这些发现为 L-茶氨酸的生物合成提供了更多优势。

基于这些发现，该团队尝试了 L-茶氨酸的转化，并确定了在 BlGGT 中合成 L-茶氨酸的最佳反应条件，即 pH 为 9、酶活性 0.5 U/mL、反应时间7小时。在此条件下，L-茶氨酸的转化率达到了 65.38%。

“这些结果表明，我们的方法是提高酶生产效率并实现食品工业酶制剂安全生产极具潜力的方案。”

素材来源官方媒体/网络新闻

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