《食品科学》：吉林农业大学刘学军教授等：具有抑制酪氨酸酶活性乳酸菌的筛选及其成分分析

黑色素在皮肤特定部位的过度产生和积累会导致色素沉着过度，酪氨酸酶在黑色素合成中起主要作用，在食品工业中，它也是新鲜切割的水果和蔬菜酶促褐变的重要原因之一。在参与黑色素生物合成的酶促反应中，酪氨酸酶（多功能含铜金属酶）作为限速酶起着核心作用。

由植物、真菌和细菌产生的酪氨酸酶抑制剂因其低毒性和生物利用性而被视为有吸引力的潜在皮肤美白剂，特别是对于食品和化妆品应用。益生菌是通过定植在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。这些化合物具有免疫调节、抗癌、抗衰老和抗菌作用。研究报道一些益生菌具有抗氧化作用，可促进皮肤健康。

吉林农业大学食品科学与工程学院的张雪，李雪峰，刘学军*等选取5 株乳酸菌进行系统评价其发酵上清液、菌体细胞和破碎提取物的酪氨酸酶抑制活性和抗氧化能力。选取最优菌株进行菌种鉴定。对其乳酸菌发酵上清液成分进行液相色谱-质谱（LC-MS）联用的非靶向代谢组学分析，鉴定并研究具有酪氨酸酶抑制活性代谢物。通过评估代谢物对小鼠黑色素瘤细胞（B16F10）抗氧化活性、酪氨酸酶活性和黑色素含量，评估其美白能力。

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抑制酪氨酸酶乳酸菌菌株的筛选

1.1 乳酸菌菌株抑制酪氨酸酶能力的测定

样品为采集自新疆奶疙瘩、阿勒泰腊肠、南昌腊肠、延边辣白菜不同地区的特色食源性物质中分离筛选出5 株乳酸菌。具体样品信息见表1、图1。

由图2可知，5 株菌各组分均表现出一定的抑制酪氨酸酶能力，但抑制能力差异较大。各组分发酵上清液的抑制率显著高于其他2 个组分（P＜0.05），其中MNJ-9乳酸菌的抑制率最高，可达68.9%。菌体细胞组和破碎提取物的抑制能力较弱，仅为50.9%和34.8%。而AC-4破碎提取物抑制酪氨酸酶能力最低（7.87%）。一些乳酸菌发酵上清液中多肽和胞外多糖多糖分子已被证明是天然抗氧化剂，在清除自由基和抑制体内酪氨酸酶有较好的表现，研究表明乳酸菌LRH113发酵上清液具有美白、保湿、抗氧化等功效。抑制酪胺酸酶活性为曲酸的84.4%。

1.2 乳酸菌菌株抗氧化能力的测定

由图3可知，5 株菌各组分均表现出一定的DPPH自由基清除能力，但抑制能力差异较大。发酵上清液的抑制率显著高于其他2 个组分（ P ＜0.05）。其中MNJ-9清除率最高可达93.1%。破碎提取物清除率AC-4最低12.9%。以上结果表明，菌种MNJ-9发酵上清液的抑制酪氨酸酶能力和自由基清除能力最高。抗氧化剂是酪氨酸酶活性和黑色素产生的良好抑制剂。实际上，某些抗氧化剂已被用作黑色素生成抑制剂，例如红花黄-红花黄色素的主要成分，显示出抗氧化和抗黑色素生成活性。

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乳酸菌菌株的鉴定

2.1 生理生化鉴定

由表2可知，参照《常见细菌系统鉴定手册》初步判断菌株MNJ-9为肠球菌属（Enterococcus sp.）。

2.2 16S rDNA鉴定

由图4可知，测序菌株MNJ-9的目的片段序列为1 200 bp。利用BLAST软件，从GenBank中选择10 个菌株的16S r DNA基因序列，利用MEGA 5软件构建系统发育树，结果见图5，菌株MNJ-9与NR 114742.1 Enterococcus faecium strain DSM 20477亲缘关系达100%。确定菌株MNJ-9为屎肠球菌（E. faecium）。

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基于LC-MS鉴定乳酸菌发酵上清液主要成分

基于LC-MS非靶向的方式对MNJ-9发酵上清液进行分析，所得数据进行生物信息学分析。MNJ-9发酵上清液的正负离子流图如图6所示。共鉴定出发酵上清液化学成分425 种。其中正离子模式229 种，负离子模式196 种。表3显示了发酵上清液中主要成分的含量，每个成分占总量1.5%以上。

酪氨酸酶在黑色素生成中起重要作用。可以通过抗氧化和抑制酪氨酸酶实现对黑色素生成的抑制。如图7所示，10 种化合物都具有抑制酪氨酸酶活性和DPPH自由基清除能力，但抑制率最强的为5-氨基戊酸（最高可达69.5%和93.4%），(2S)-2-羟基-3-苯基丙酸乙酯可达63.5%和85.4%，左旋肉碱仅为45.6%和59.2%。综上实验可知，5-氨基戊酸抑制酪氨酸酶活性和DPPH自由基清除率效果最优。5-氨基戊酸类抗肿瘤药物是近年来兴起的药物开发的新领域，目前全世界发病率最高的癌症依次为乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、皮肤非黑素瘤、胃癌和肝癌。传统的化疗药物具有很大的副作用，如恶心呕吐、毛发脱落、腹胀腹泻等。5-氨基戊酸类药物的发现为抗肿瘤药物开发提供了新的窗口。(2S)-2-羟基-3-苯基丙酸乙酯存在于各种食物中，如蜂蜜、泡菜和酸面团。它对食源性致病菌和腐败霉菌表现出多功能的抗菌活性。肉碱是一种水溶性氨基酸衍生物，存在于身体的许多细胞中。左旋肉碱补充剂可能通过改善糖尿病患者的葡萄糖摄取、贮存和氧化影响葡萄糖代谢，这些抗氧化和抗炎特性在血脂异常、胰岛素敏感性和蛋白质营养中起着有益的作用。

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细胞分析

4.1 细胞存活率

任何潜在的化疗保护物质（如5-氨基戊酸）的进展必须首先涉及对其安全性和敏感性的评估。实验进行了MTT测定，以评估不同质量浓度5-氨基戊酸对B16F10细胞的影响。在保证不影响细胞存活率的前提下，若对黑色素合成具有一定的抑制效果，则说明该药物在细胞水上具有一定的美白作用。分别取空白组和样品组连续处理72 h，由图8可知，样品组质量浓度逐渐提高，细胞存活率逐渐降低，70 μg/mL质量浓度下，72 h内细胞存活率≥80%，视为无细胞毒性，即对体外培养的小鼠B16F10黑色素瘤细胞无明显毒性；因此，70 μg/mL样品不会影响后续细胞实验的结果。

4.2 细胞内黑色素含量

皮肤黑色素细胞的含量及其合成黑色素的能力主要决定了皮肤颜色深浅。为研究5-氨基戊酸抑制B16F10细胞黑色素含量的能力，首先构建α-MSH诱导黑色素表达模型，如图9所示，与空白组比较，α-MSH对B16F10细胞诱导后，细胞内黑色素含量明显增加，说明模型构建成功。处理72 h后随着5-氨基戊酸质量浓度升高，细胞内黑色素含量逐渐降低，并呈现剂量依赖。5-氨基戊酸质量浓度10～70 μg/mL时，细胞内黑色素含量由85.4%下降为45.2%。结果表明，5-氨基戊酸对细胞内黑色素生成具有抑制作用，在细胞水平具有良好的效果。

4.3 细胞内酪氨酸酶活性

酪氨酸酶通过催化B16F10细胞内的酪氨酸生成黑色素，是黑色素合成的主要限速酶，其活性决定黑色素的合成。通过抑制细胞内酪氨酸酶的活性，可抑制细胞内黑色素的产生。由图10可知，与模型组相比，5-氨基戊酸和曲酸均表现出对细胞B16F10细胞内酪氨酸酶活性抑制作用。5-氨基戊酸对细胞内酪氨酸酶的抑制作用呈剂量依性，质量浓度为10～70 μg/mL时，细胞内酪氨酸酶相对活性由76.53%下降到40.5%。结果表明5-氨基戊酸对B16F10细胞的酪氨酸酶活性有明显抑制作用。

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结论

本实验比较5 株乳酸菌发酵上清液、菌体细胞和破碎提取物，进行酪氨酸酶抑制率测定和DPPH自由基清除率分析。结果表明，MNJ-9的发酵上清液抑制酪氨酸酶活性和DPPH自由基能力最强，经鉴定MNJ-9为屎肠球菌。采用非靶向代谢组学分析鉴定了MNJ-9屎肠球菌发酵上清液产生的代谢物。进行10 种主要成分分析。研究表明，5-氨基戊酸有效抑制酪氨酸酶活性。采用小鼠B16F10黑色素瘤细胞作为细胞模型，研究5-氨基戊酸对细胞活力、细胞内酪氨酸酶活性和黑色素合成的影响。结果显示，5-氨基戊酸在保证细胞安全生长的基础上抑制黑色素的生成，而且随着质量浓度增加，抑制酪氨酸酶活性、黑色素合成含量降低，这表明5-氨基戊酸作为酪氨酸酶和黑色素生成的候选抑制剂，可包含在具有皮肤美白化妆品配方中。

本文《具有抑制酪氨酸酶活性乳酸菌的筛选及其成分分析》来源于《食品科学》2023年44卷第18期193-199页，作者：张雪，李雪峰，胡瑞峰，郭万春，刘学军。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221224-233.。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑；云南师范大学生命科学学院 母朵银；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。