FSHW | 鲟鱼软骨中抗炎肽的纯化和鉴定

本文系Food Science and Human Wellness原创编译，欢迎分享，转载请授权。

Introduction

炎症反应一般从中性粒细胞开始，中性粒细胞破坏并清除异物颗粒和受损组织，随后由巨噬细胞继续吞噬。持续的炎症反应会导致神经退行性疾病、癌症、心血管疾病和糖尿病等相关疾病的发生。体内平衡和组织修复的恢复可能与巨噬细胞的分化有关。巨噬细胞通过将基因表达转移到不同的细胞过程，减轻炎症引起的组织损伤和内环境紊乱。

目前，抗炎疗法可以通过靶向蛋白质已知的信号通路来设计。然而，合成化学分子的副作用较大，限制了其临床应用。食品副产物中的天然生物活性多肽因其低毒性和可及性被广泛应用为抗炎、抗氧化和抗高尿酸血症药物。发酵和酶解通常有利于活性物质的释放。之前的研究报道了鲟鱼软骨醇溶性水解产物中的多肽组分具有抗炎潜力，但具体的多肽及其作用机制仍不清楚。

本文进一步纯化鲟鱼软骨醇溶性水解产物中的多肽，利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定分析对一氧化氮（NO）抑制作用最强的肽段，并测定特异性肽段对RAW264.7巨噬细胞中NO以及IL-6、IL-10和转化生长因子-β（TGF-β）等炎性细胞因子的影响。通过RNA测序和蛋白质印迹分析其抗炎机制。

Results

ODS疏水色谱和NO抑制

SP-120-50-ODS疏水色谱主要通过亲、疏水性的差异分离多肽。通过ODS疏水色谱分离F3的4种组分，即ODS-1、ODS-2、ODS-3和ODS-4（图1A）。疏水性随洗脱液中乙醇浓度的增加而增加。如图1B所示，不同ODS组分均可抑制巨噬细胞中NO的释放。

图1 （A）通过SP-120-50-ODS疏水色谱分馏并在220 nm下检测的F3多肽组分洗脱图，（B）不同成分的NO检测

多肽合成

鉴于ODS-3对NO的抑制率较高，进一步测定其肽序列。从NCBI数据库中筛选得到鲟鱼的5段肽序列，分别命名为LP4、LE4、LL4、VP9和FD10。与BIOPEP-UWM中已知的活性肽相比，LP4被鉴定为具有ACE抑制活性，而其他活性肽未见报道。进一步探究了这5种合成肽的体外抗炎活性及其作用机制。

合成肽对NO释放的影响

5种不同合成肽处理巨噬细胞后的细胞活力如图2A所示。结果表明，250 μmol/L VP9的细胞活力低于90%，除此之外，其余合成多肽在2~250 μmol/L的浓度范围内对细胞活性无显著影响。在RAW264.7细胞炎症模型中，5种合成肽在2、10、50和250 μmol/L剂量下显著降低NO的产生（图2B）。2、10 μmol/L较低的浓度即可有效减少NO的产生，同时不影响细胞活力，因此选择这两个浓度进行后续研究。

图2 5种合成肽在LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中（A）24小时细胞活力和（B）NO释放

合成肽的细胞因子测定

FD10肽对NO的抑制率低于其他4种肽。促炎细胞因子是评价多肽抗炎活性的重要指标。多肽LP4、LE4、LL4和VP9显著降低IL-6的平均释放水平（图3），而FD10对IL-6的表达没有影响。抗炎细胞因子是细胞内炎症反应的另一种重要表现。4种合成肽对IL-10和TGF-β具有不同的影响。以上结果表明，这4种合成肽可以有效缓解细胞内炎症。

图3 LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞在2、10 μmol/L合成肽预处理后的细胞因子（A）IL-6、（B）IL-10和（C）TGF-β水平

DEGs的筛选

鉴于IL-10受LLEL处理的影响最为显著，进一步通过RNA测序探究LLEL（HLL4/HP4）对全局基因表达的影响。共获得490种差异表达基因（DEGs），其中包括197个上调基因和293个下调基因（图4A）。DEGs的聚类分析热图如图4B所示。

图4 LPS诱导组与HLL4（10 μmol/L，HP）干预组中（A）DEGs、（B）DEGs聚类分析热图、（C）GO富集分析和（D）KEGG富集分析

DEGs的功能和途径富集分析

为探究DEGs的功能，采用Goatools软件进行GO分析。结果如图4C所示，GO富集程度排名前20位的均集中在生物过程（BP）上，主要包括IL-17产生的正向调控、细胞活化、对细菌来源分子的响应、细胞成分运动的正向调控、MAPK级联的正向调控。

KEGG富集结果（图4D）表明，LLEL显著影响MAPK信号通路、NOD-like受体信号通路、TNF信号通路、AGE-RAGE信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、癌症通路、IL-17信号通路和百日咳。特别地，在GO和KEGG富集分析中发现IL-17和MAPK信号通路直接与炎症反应结合。因此，进一步研究了IL-17信号通路中所涉及的MAPK信号通路。

蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析

MAPK和IL-17信号通路中的基因如图5A所示，表明LPS诱导组（M）和和LLEL（HP）组之间的表达差异。构建的PPI网络进一步表明连接基因在蛋白质水平上的关系（图5B）。

图5 参与MAPK和IL-17信号通路的DEGs的（A）热图和（B）PPI网络图

合成肽对MAPK通路蛋白表达的影响

巨噬细胞中的蛋白质表达结果如图6所示。2 μg/mL LPS刺激RAW264.7巨噬细胞22小时后，iNOS、p38、ERK和JNK的蛋白表达显著增加。INOS是M1巨噬细胞的主要标志，与NO的释放有关。LLEL干预会抑制INOS的表达。与LPS诱导组相比，2 μmol/L浓度下MAPKs中p38、ERK和JNK没有显著差异。LLEL（10 μmol/L）显著降低p38、ERK和JNK的磷酸化水平。以上结果表明，LLEL的抗炎作用部分原因是MAPK信号通路的抑制。

图6 LL4（2、10μmol/L）对RAW264.7巨噬细胞中iNOS和MAPK信号通路的影响

Discussion

本研究首次报道了LLEL部分通过下调巨噬细胞中MAPK信号通路和iNOS表达从而表现出抗炎特性，这在BIOPEP数据库中从未报道。

在炎症过程中，活化的巨噬细胞产生NO和细胞因子（包括IL-6和IL-1β）。通过测定LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中亚硝酸盐的积累水平，探究不同分离对NO释放的影响。在LPS刺激下，NO产量增加。经肽组分预处理后，均表现出不同程度的抑制作用，尤其是ODS-3。ODS-3对NO较高的抑制作用可能与其疏水性较强有关。疏水性越强，其体外抗炎作用可能越好。本文中肽组分可以减少巨噬细胞中促炎细胞因子IL-6的产生。LP4和LE4肽组中，巨噬细胞分泌的抗炎细胞因子IL-10发生上调，同时TGF-β水平增加。经LL4和VP9肽预处理后，TGF-β水平反而降低，这可能是由于TGF-β/IL-10介导的调控机制受到抑制或其他炎症因子的共同作用。

在DEGs的KEGG富集途径中，MAPK和IL-17信号通路与LLEL的抗炎作用有关。通过测定LPS和MAPKs激活的iNOS蛋白表达进一步验证RNA-seq结果。LLEL通过下调iNOS蛋白水平抑制炎症介质NO的产生，从而表现出抗炎活性。LLEL（10 μmol/L）可以抑制p38、ERK和JNK的磷酸化。iNOS表达、NO生成和IL-6分泌的抑制可能归因于该浓度下p38和JNK通路的累积抑制。

Conclusion

综上所述，本研究表明从鲟鱼软骨中提取的新型多肽LLEL可以阻断MAPKs的磷酸化，从而发挥抗炎作用。以上结果突显了LLEL多肽在功能食品工业中的应用前景。然而，仍需进一步的体内和人体研究来阐明当前研究的意义。

Purification and identification of anti-inflammatory peptides from sturgeon (Acipenser schrenckii) cartilage

Li Yuana, Qian Chua, Bei Yanga, Wei Zhanga, Quancai Suna,*, Ruichang Gaoa,b,*

a School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China

b Bio-resources Key Laboratory of Shaanxi Province, School of Biological Science and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723001, China

*Corresponding authors.

Abstract

Cartilage is a nonedible byproduct with little saleable value. However, previous studies have proposed the possibility of producing peptides from cartilage with immune function modulation potential. The current study aimed to investigate the potential anti-inflammatory activity of peptides derived from sturgeon (Acipenser schrenckii) cartilage in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW264.7 macrophages. Five peptide sequences, including four novel peptides, were identified from ethanol-soluble cartilage hydrolysates. Among these five peptides, LTGP, LLLE, LLEL and VGPAGPAGP reduced the production of nitric oxide (NO) and interleukin-6 (IL-6) while increasing interleukin-10 (IL-10) excretion. Transcriptome analysis suggested the inhibition of activated mitogen-activated protein kinase (MAPK) and interleukin-17 (IL-17) signaling pathways after LLEL intervention. MAPK, which is involved in the IL-17 signaling pathway, was further proved to be blocked by downregulating the phosphorylation of p38, extracellular-signal regulated protein kinase (ERK), and c-jun N-terminal kinase (JNK). This novel peptide offers an attractive approach to develop functional foods.

Reference:

YUAN L, CHU Q, YANG B, et al. Purification and identification of anti-inflammatory peptides from sturgeon (Acipenser schrenckii) cartilage. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(6): 2175-2183. DOI:10.1016/j.fshw.2023.03.030.

翻译：倪皓洁（实习）

编辑：王佳红；责任编辑：张睿梅

封面图片来源：图虫创意