时间演化揭示侵袭性神经内分泌小细胞前列腺癌转分化的谱系变化

撰文 | 咸姐

小细胞神经内分泌（SCN）癌是一种侵袭性变体，起源于多种组织，如肺和前列腺。SCN的特点是组织学上明确的小细胞形态，细胞密集堆积，细胞质稀少，分化差，肿瘤生长侵袭性强，以及典型神经内分泌标志物（包括SYP, CHGA和NCAM1）的表达。除了表型上的相似外，在临床注释的肿瘤中，多种组织类型的SCN癌症都表现出惊人的转录和表观遗传趋同【1,2】。

小细胞神经内分泌前列腺癌（SCNPC）或是新发的（<1%的未经治疗的前列腺癌病例），或是由于治疗介导的去势耐受性前列腺癌（CRPC）（~20%的耐受病例）转化发生的。CRPC是前列腺腺癌（PRAD，通常对雄激素剥夺治疗有反应）的一种耐药变体。从PRAD到SCNPC状态的转分化需要在染色质水平上进行复杂的表观遗传学重编程，导致由许多关键主调控因子驱动的转录变化【3】。尽管这个过程中很多因素的重要性已经得到证实，但在SCNPC的发展过程中，相关的表观遗传学和转录变化的时间序列仍然不明确，而对癌症时间演变的研究无疑将有助于揭示转录因子定义的亚型与细胞可塑性之间的联系。

近期，来自美国加州大学洛杉矶分校的Thomas G. Graeber团队在Cancer Cell上在线发表题为Temporal evolution reveals bifurcated lineages in aggressive neuroendocrine small cell prostate cancer trans-differentiation的文章，对泛小细胞神经内分泌癌症模型（称为PARCB）进行了多组学时程分析，确定了发育生物学中常见的弧形高熵轨迹。通过单细胞分辨率的进一步定位揭示了ASCL1或ASCL2互斥表达所定义的两个不同的分叉谱系，通过转录因子组在发育阶段的时间调节揭示了细胞重编程先于神经元程序的诱导，并证实TFAP4和ASCL1/2反馈是ASCL1和ASCL2表达的潜在调节因子。以此提供了时间转录模式，揭示了前列腺癌和肺癌之间的泛组织相似性，以及与正常神经内分泌细胞状态的联系。

为了确定前列腺癌发展过程中SCN分化事件的时间，本文研究人员使用了PARCB模型系统。对从10名PRAD患者的上皮组织良性区域提取的基底细胞由致癌慢病毒PARCB混合物进行独立转化，随后在体外类器官系统中培养。再将来自每个患者组织样本的转化的类器官扩增细胞皮下植入多只免疫缺陷小鼠，以便从匹配的起始材料中按时间顺序收集肿瘤。每隔大约两周收集一次肿瘤，直到肿瘤大小达到1 cm3或出现溃疡，每个患者系列包含5-6个时间点样本，包括了从基底细胞到类器官再到肿瘤，转化的肿瘤细胞经过荧光激活细胞分选（FACS）纯化，然后进行多组学测序和分析。组织学和组学数据显示，PARCB病程肿瘤概括了临床观察到的表型和转录变化，并为研究SCNPC发展的时间演变提供了模型系统。

研究人员首先使用bulk RNA测序对基因表达进行了时间分析，以了解SCNPC转分化过程中转录背景的变化。对转录组数据根据相应的差异基因模块定义样本的分级聚类（HC），发现6个聚类与采集时间相对应。主成分分析（PCA）显示每个患者序列的单个转化路径遵循总体一致的“弧形”轨迹，在后期样本中出现明显的分叉，存在两个定义SCNPC肿瘤表型末端的转录程序或终点。对相应的6个差异基因模块进行GO富集分析，确定了各个聚类之间独特或共享的生物过程，提示从腺癌到SCN状态的转分化是一个系统协调的过程，涉及一个过渡阶段，随后是富含神经元/神经内分泌基因特征的分叉通路。

随后，研究人员通过使用ATAC测序的染色质可及性分析，通过对1600多个转录因子的广泛调查来定义SCNPC的转录演化。结果显示，从肿瘤的转化期到晚期，染色体上总体可接近的染色质峰显著增；对ATAC测序数据的PCA显示出于RNA测序数据一致的弧形分叉轨迹。香农熵可被用来估计生物样品改变细胞状态的可塑性潜力，研究人员发现转化期的样本具有最高的熵，表明在转分化过程中存在一个高电位且不太明确的转录状态。深入分析结果显示，序列转录调节因子通过高度熵和可接近的染色质状态调节重编程和神经内分泌程序。值得一提的是，对转化各个阶段的排名最高的转录因子表达进行分析发现，ASCL1和ASCL2的表达在肿瘤晚期升高，但它们的表达在不同的肿瘤终点富集，提示它们对分叉轨迹具有重要作用。

为了确定肿瘤时间进程内的异质性程度，研究人员又对四个时间的系列肿瘤组进行了单细胞RNA测序。单细胞分析结果进一步支持了上述测序中观察到的整体基因表达和染色质可及性模式。同时，将单细胞投射到bulk RNA测序样本生成的PCA框架上发现，通过bulk RNA测序明显聚类的重量缺失主要由处于相应不同转录状态的单细胞组成，具有一定程度的异质性，肿瘤中高表达的转录因子在单细胞中也显示出异质性模式。转化期和晚期肿瘤的基因波动程度最高，进一步强调了在转分化过程中增加的肿瘤内异质性的潜在作用。此外，分析结果也进一步验证了ASCL1和ASCL2的互斥表达模式，证实ASCL2在非NE细胞/腺癌中普遍富集，而ASCL1在高NE细胞/SCNPC中更为丰富，ASCL1和ASCL2双阳性细胞的出现频率较低，主要见于SCNPC肿瘤，可能反映了腺癌和SCN表型之间的过渡状态。

鉴于ASCL1和ASCL2在单细胞中的表达水平是互斥的，研究人员遂通过推断克隆示踪分析探索ASCL1和ASCL2是否代表不同的细胞亚系。结合转录组分析以及实验验证，研究人员证实ASCL1和ASCL2分别代表了SCNPC中神经内分泌富集和具有干细胞样的独立细胞亚系和转录程序。进一步地对多种临床数据进行分析，研究人员在多癌和泛癌环境中都观察到ASCL1和ASCL2之间的相反且互斥的关系，并且在单细胞水平上观察到强烈的互斥性。而这种互斥是由于两种原因：1）ASCL1和ASCL2相互制约着对方的表达；2）ASCL1和ASCL2之间存在一个相互的、非对称的转录调控关系，两者拥有一个共同的正调控因子——TFAP4，其通过调节与各自基因调控元件的差异结合来使它们交替转录。

综上所述，本研究利用PARCB模型绘制了一副由时间转录因子调控的SCNPC转分化的蓝图，尤其揭示了ASCL1和ASCL2定义的小细胞癌中不同的分叉亚系转分化轨迹，以及泛癌背景下的二元转录谱。本研究模型的结果深入了解了不同神经内分泌主调节因子之间的调控串扰，并为确定阻断这种具有临床挑战性的转分化病例的候选方案提供了新资源。

https://doi.org/10.1016/j.ccell.2023.10.009

制版人：十一

参考文献

1. Nadal, R., Schweizer, M., Kryvenko, O.N., Epstein, J.I., and Eisenberger, M.A. (2014). Small cell carcinoma of the prostate.Nat. Rev. Urol.11, 213–219.

2. Pietanza, M.C., Byers, L.A., Minna, J.D., and Rudin, C.M. (2015). Small cell lung cancer: will recent progress lead to improved outcomes? Clin.Cancer Res.21, 2244–2255.

3. Davies, A., Zoubeidi, A., and Selth, L.A. (2020). The epigenetic and transcriptional landscape of neuroendocrine prostate cancer.Endocr. Relat. Cancer27, R35–R50.