《食品科学》：甘肃农业大学陈骋助理研究员等：宰后冷藏初期活性氧调控糖酵解对牛肉嫩度的影响

牛肉的嫩度作为评价肉品质的适口性指标，是决定消费者购买意向的重要因素，而宰后冷藏过程中糖酵解对嫩度的改善发挥着重要作用。活性氧（ROS）作为分子氧还原过程的产物，在宰后动物肌肉细胞中大量积累，并参与包括糖酵解在内的多种生化反应调控。

甘肃农业大学食品科学与工程学院的郭雨轩，陈 骋*，师希雄等选取牛胴体背最长肌，分别采用ROS激活剂过氧化氢（H2O2）、ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）和生理盐水处理新鲜肉样，探究宰后不同冷藏时间（0.5、6、12、24、48 h）ROS对牛肉糖酵解代谢水平和嫩度的影响，并利用TMT蛋白质组学技术对宰后冷藏24 h的H2O2处理组和对照组样品的差异表达蛋白进行鉴定与定量分析，筛选出糖酵解通路中的关键蛋白，进而明确ROS调控糖酵解通路的机制及其在牛肉嫩化过程中的作用，以期进一步完善肉品质形成和调控理论。

1 宰后冷藏过程中牛肉糖酵解水平变化

宰后冷藏过程中肌肉内正常的氧气供应中断，能量代谢方式从有氧氧化转化为无氧糖酵解，糖原和乳酸作为糖酵解反应的底物和产物，其含量的变化直接反映了糖酵解水平和速率。如图1A所示，3 组样品的糖原含量均随着冷藏时间的延长而下降，其中H2O2处理组的糖原含量在6～24 h内显著低于对照组和NAC处理组（P＜0.05）。H2O2处理组在6～24 h的糖原净消耗分别是对照组和NAC处理组的1.31 倍和1.84 倍。如图1B所示，随冷藏时间延长，3 组样品乳酸含量呈显著上升趋势，H2O2处理组乳酸含量在6～24 h内显著高于其余两组（P＜0.05），并在12 h达到最高水平，其0.5～12 h乳酸含量增量分别比NAC处理组和对照组高9.21%和4.96%，这与图1A中糖原的快速消耗相对应。上述结果表明H2O2处理显著提升了牛肉糖酵解水平，使糖原消耗和乳酸积累速率加快，而NAC处理则抑制了糖酵解进程。

2 宰后冷藏过程中牛肉品质指标变化

为探究ROS是否通过调控糖酵解水平影响牛肉的嫩度，对肉样的pH值、剪切力和MFI进行测定。由图2A可以看出，3 组样品的pH值在0.5 h时没有显著差异，但随着冷藏时间的延长均呈现显著下降的趋势，其中H2O2处理组pH值在6～24 h显著低于其余两组（P＜0.05），并在12 h达到极限pH值，比对照组和NAC处理分别提前了12 h和36 h。这与乳酸含量的变化趋势（图1B）相符，说明H2O2处理能够提升宰后冷藏初期牛肉糖酵解水平，加速乳酸积累并引起pH值迅速下降。pH值变化速率直接影响肉的嫩度，在肉品质的形成过程中发挥重要作用。pH值降低使肌肉内环境酸化，促使肌球蛋白和肌动蛋白形成永久横桥，肌肉收缩而导致宰后僵直。此外，pH值降低引起肌浆网功能受损，导致细胞内钙离子过载，引起钙蛋白酶、组织蛋白酶和细胞凋亡蛋白酶的活化，进而使这些酶迅速分解肌原纤维蛋白质，最终改善肉的嫩度。

从图2B可以看出，3 组样品的剪切力随冷藏时间的延长均呈先上升后下降的趋势。其中，H2O2组的剪切力在12 h时达到最大（宰后僵直过程），比其余两组提前12 h，表明H2O2能够缩短僵直期，从而使肌肉嫩化进程提前。这可能与H2O2组较快的pH值下降速率有关。宰后冷藏过程中，当pH值下降到6.0以下时，肌肉细胞中μ-钙蛋白酶被激活，后者迅速水解肌原纤维蛋白质，导致肌肉剪切力迅速下降。上述作用可能是H2O2处理组在12 h时pH值达到最低且剪切力呈现显著降低趋势的原因。

MFI可反映肌原纤维降解的程度，是评价肌肉嫩度的主要指标。由图2C可以看出，3 组样品的MFI均呈现显著上升趋势，6～48 h内H2O2处理组的MFI显著高于对照组和NAC处理组（P＜0.05）。相反，NAC处理组MFI在6～48 h内均显著低于对照组（P＜0.05）。MFI与肌肉纤维的破坏程度呈正相关，肌肉pH值的下降会激活μ-钙蛋白酶、Caspases-3和组织蛋白酶B/D/L等重要的蛋白酶，进而加速肌原纤维结构蛋白的分解，造成肌原纤维及肌节的横向断裂，最终导致MFI上升和剪切力下降。

3 糖酵解差异蛋白鉴定结果

本研究发现 处理能够提升宰后冷藏初期牛肉糖酵解水平，并且有利于肉嫩度的改善。为探究ROS在复杂糖酵解反应进程中的作用机制，进一步采用TMT定量蛋白质组学技术对冷藏24 h时H2O2处理组和对照组样品进行蛋白质组学分析。如表1所示，从两组样品共得到二级质谱谱图总数170 424 个，鉴定肽段匹配到的谱图数26 711 个，肽段总数7 090 个。在扣除空白值、确定可信蛋白的基础上，以上调倍数大于1.5或下调倍数小于0.667、P＜0.05的条件筛选差异表达蛋白。如图3所示，共筛选出271 个差异表达蛋白，其中上调蛋白135 个，下调蛋白136 个。

为确定数据的准确性，使用层次聚类算法对差异表达蛋白进行聚类分析，结果如图4所示，H2O2处理组的样品聚为一类并与对照组样品分离，且H2O2处理组差异表达蛋白A0A4W2CXP9到A0A3Q1M3G5表达量（黄绿色区域）高于对照组，但对照组差异表达蛋白L8IJH1到A0A4W2CB58表达量（黄绿色区域）却高于H2O2处理组，表明不同处理样品的蛋白组具有显著差异。同时，不同处理组之间层次分明，表明差异表达蛋白的合理性，验证了差异表达蛋白生物性重复良好。

4 生物信息学分析结果

为明确ROS调控糖酵解改善肉嫩度的差异表达蛋白，对差异表达蛋白进行GO注释、KEGG功能富集、PPI分析。GO注释分为细胞成分、生物过程、分子功能，其中前10 个条目如图5A所示。不同处理下差异表达蛋白主要分布在细胞、细胞部分，所参与的生物过程集中在代谢和单生物过程，涉及的分子功能有催化活性和结合。肌肉细胞内不同通路互相协调，共同调节细胞生物学行为。对筛选出的差异表达蛋白进行KEGG富集分析，共富集到197 条通路，其中丙酮酸代谢、糖酵解/糖异生、肌肉收缩通路富集最为显著（图5B）。通过GO注释与KEGG富集筛选出糖酵解差异表达蛋白，使用String 10.0数据库对其进行PPI分析，结果如图5C所示，差异表达蛋白磷酸甘油酸变位酶（PGAM）、醛脱氢酶7家族成员A1（ALDH7A1）、醛脱氢酶2（ALDH2）、醛脱氢酶3家族成员A2（ALDH3A2）、2-磷酸-D-甘油酸水解酶（ENO）、丙酮酸脱氢酶E1亚基β（PDHB）、果糖-二磷酸醛缩酶C（ALDOC）、乳酸脱氢酶B（LDHB）、丙酮酸脱氢酶E1亚基α（PDHA）、丙酮酸激酶M1/2（PKM2）形成网状结构，彼此之间相互交叉，其中以PGAM、ENO、PDHB为主要节点，共同作用激活糖酵解酶相关基因，加速糖酵解的表达。

5 ROS调控糖酵解通路机制

通过对差异表达蛋白进行GO注释和KEGG通路分析，确定差异表达蛋白参与的生物过程与富集通路，并对富集的糖酵解通路进行PPI分析，在此基础上筛选出10 种糖酵解关键表达蛋白，H2O2处理使其中8 种蛋白表达上调、2 种蛋白表达下调，具体如表2所示。

从生物信息学分析结果来看，不同ROS水平下PGAM、ENO和PDHB是调控糖酵解反应的关键节点蛋白（图5C）。其中PGAM催化3-磷酸甘油酸反应生成2-磷酸甘油酸，是糖酵解过程中的关键酶。近期研究发现，PGAM可作为一种重要蛋白质调节肉的嫩度、色泽、pH值，与乳酸积累呈显著正相关。因此，推断PGAM是调控糖酵解改善嫩度的关键蛋白之一。ENO是由ENO1、ENO2等复合的一种多功能蛋白。过量表达的ENO1会激活磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B及其下游信号，从而上调糖酵解进程。PDH是丙酮酸还原酶复合物的组成部分，负责催化丙酮酸产生乙酰辅酶A参与三羧酸循环。通过免疫印迹分析表明，脯氨酰羟化酶3可以与PDHB相互作用上调PDH，提高细胞氧化磷酸化途径的能量代谢水平。

除上述3 个节点蛋白外，ALDH7A1、ALDH3A2、ALDH2同属于醛脱氢酶，醛脱氢酶是多种酶的复合体，主要存在细胞质、线粒体等位置。GO注释表明分子功能为氧化还原酶活性，可将醛、氧基团中的辅酶I磷酸化为辅酶II，进而调节糖酵解、脂肪酸氧化等途径。同时，过表达的醛脱氢酶会加快糖酵解和三羧酸循环，对肉品质的改善发挥积极作用。有研究指出，醛脱氢酶与ENO相互作用对稳定癌细胞糖酵解途径的能量供应发挥重要作用。ALDOC作为糖酵解途径中的关键酶，负责催化果糖-1,6-二磷酸向甘油醛-3-磷酸和磷酸二羟基丙酮的可逆转化。LHD是调控细胞中乳酸积累的关键酶，具有LDHA和LDHB两种亚型，后者催化丙酮酸盐转化为乳酸盐。PDHA表达量的下调则会降低丙酮酸和乙酰辅酶A产生还原型辅酶I的速率，进而反向促进无氧糖酵解途径的能量代谢水平，本研究也证实了这一点。结合上述关键差异表达蛋白的调控机制及糖酵解、嫩度的结果，可以推测H2O2处理可促进上述糖酵解通路中关键蛋白的表达，进而提升宰后冷藏初期牛肉的糖酵解水平，导致pH值下降速率加快，为牛肉嫩度的改善创造了有利条件。

结 论

宰后冷藏初期H2O2处理能够提高牛肉糖原消耗和乳酸积累速率，使肌肉快速达到极限pH值，缩短宰后僵直期。同时，与对照组和NAC处理组相比，H2O2处理显著提升了牛肉MFI，显著降低了牛肉成熟后期的剪切力，说明ROS可通过促进糖酵解发挥改善嫩度的作用。进一步利用蛋白质组学技术研究发现，H2O2处理使牛肉糖酵解通路中的8 种蛋白表达上调、2 种蛋白表达下调，其中以PGAM、ENO、PDHB为核心的8 种上调蛋白与下调的PDHA相互协调，加快糖酵解进程。由此证实，ROS通过调控糖酵解通路中关键蛋白质的表达提升牛肉糖酵解水平，进而间接促进肉嫩度的改善。上述机制的发现有助于完善宰后冷藏过程中基于能量代谢的肉品质形成机理，为预测和改善肉品质提供一定的理论依据。

本文《宰后冷藏初期活性氧调控糖酵解对牛肉嫩度的影响》来源于《食品科学》2023年44卷第15期172-180页，作者：郭雨轩，陈 骋*，师希雄，郭兆斌，马国源，张玉斌，张 丽，余群力。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220927-301。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑；中国农业大学食品科学与营养工程学院 崔芯文；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。