复方药理-if7.5 | 中国中医科学院: 心舒宝片通过DCN/PPARα/PGC-1α/P300信号改善心衰心肌损伤

导读

心力衰竭（HF）是一种复杂的临床综合征，由于心脏结构或功能紊乱而导致心室功能受损。据报道，中药复方心舒宝片（XSB）具有保护心肌细胞、降低心衰风险的临床疗效；然而，XSB降低HF风险的潜在机制尚未阐明。因此，我们的研究旨在通过使用HF模型大鼠和H9c2细胞缺氧-葡萄糖剥夺来研究XSB的治疗效果和潜在机制。动物实验的超声心动图和病理学特征表明，XSB处理4周后有效改善了心功能，改善了心肌损伤。细胞实验表明，XSB预处理显著抑制细胞凋亡，增加线粒体能量代谢。此外，体内和体外实验都表明XSB抑制了氧化应激和炎症反应。我们的研究结果进一步揭示了XSB的潜在保护机制与DCN/PPARα/PGC-1α/P300信号通路密切相关。我们的发现为HF治疗提供了新的机制见解，并为XSB治疗心血管疾病提供了药理学基础。

论文ID

原名：Xinshubao tablet ameliorates myocardial injury against heart failure via the DCN/PPARα/PGC-1α/P300 pathway

译名：心舒宝片通过DCN/PPARα/PGC-1α/P300通路改善心衰心肌损伤

期刊：Biomedicine & Pharmacotherapy

IF：7.5

发表时间：2023.8

通讯作者：杨洪军和张方博

通讯作者单位：中国中医科学院

实验设计

实验结果

1. XSB对HF大鼠心功能有改善作用

为了研究XSB对HF大鼠心室功能的影响，我们评估了血液动力学参数。HF模型组射血分数（EF）和缩短分数（FS）分别为26.39±7.60%和13.17±4.27%，说明HF大鼠模型成功建立。与假手术组相比，HF组的左室舒张末期内径（LVIDd）和左室收缩末期内径（LVID）显著增加；HF组的心搏出量（SV）、EF、心输出量（CO）和FS显著降低。与HF组相比，XSB高剂量组的LVIDd和LVIDs均下调；中等剂量和高剂量XSB组的SV、EF、CO和FS显著上调（图2）。

图1 XSB改善心力衰竭大鼠心肌损伤和氧糖剥夺（OGD） 诱导的H9c2细胞的体内外实验设计示意图

2. XSB可减轻心衰大鼠心肌损伤

与假手术组相比，HF组的心脏质量指数（0.33±0.02）显著高于假手术组（0.29±0.01，p<0.01）。与HF组相比，高剂量XSB组的心脏质量指数明显下降（0.30±0.02，p<0.05，图3A）。TTC染色显示HF大鼠的梗死面积显著大于假手术大鼠，XSB治疗显著减少了梗死面积（图3B）。HE染色显示假手术大鼠心肌细胞正常，边缘清晰，心肌纤维排列整齐。HF大鼠心肌细胞肿胀。大量的炎性细胞渗透到间质组织中。肌纤维断裂，组织紊乱，细胞间隙变宽。HF组的心肌组织病理学评分也高于假手术组。与HF组相比，XSB处理组（0.4和0.8 g/kg）的心肌细胞更加清晰，心肌纤维排列相对规则。同时，XSB处理组的病理评分降低（图3C）。Masson染色显示，与假手术组相比，HF组心肌纤维化面积百分比显著增加，表明心肌纤维化程度加重。与HF组相比，XSB处理组（0.4和0.8 g/kg）的心肌纤维化比例显著降低（图3D）。

图2 XSB改善HF大鼠心肌功能。（A）不同组的代表性经胸超声心动图。（B）对LVIDd、LVIDs、SV、EF、CO和FS等血液动力学参数进行评估。n＝3。 数据表示为平均值±标准差。与假手术组相比，*p<0.05和**p<0.01；与 HF组相比，#p＜0.05和##p＜0.01。

透射电镜观察心肌超微结构的变化。结果表明，假手术组肌原纤维排列有序，线粒体形状呈Z线垂直排列。HF组肌原纤维部分断裂溶解，线粒体肿胀空泡化，细胞间隙明显加宽。与HF组相比，XSB处理组（0.4和0.8 g/kg）的肌原纤维和线粒体恢复到规则的大小和形状。根据线粒体形态变化评分的降低，高剂量XSB组在三个治疗组中显示出最好的保护作用（图3E）。此外，HF大鼠的血清NT-proBNP、B型利钠肽（BNP）和ST2水平与假手术大鼠相比显著升高。XSB明显降低了HF大鼠的NT-proBNP、BNP和ST2的血清水平（图3F）。总的来说，我们的研究结果表明，0.4和0.8 g/kg剂量的XSB有效地减轻了HF大鼠心肌组织的损伤。

3. XSB抑制HF大鼠氧化应激和炎症反应

与假手术组相比，HF组的氧化应激相关分子T-AOC和GSH-Px的活性降低。与HF组相比，XSB处理组（0.4和0.8 g/kg）的活性增加（图4A）。此外，还检测了23种炎性细胞因子的血清水平。数据表明，与假手术组相比，HF组的血清炎性细胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α、GM-CSF、IFN-γ和VEGF增加。与HF组相比，XSB处理组（0.4和0.8 g/kg）显示上述六种炎性细胞因子水平降低（图4B）。这些结果表明，XSB可能通过抑制HF大鼠的氧化应激和炎症反应而对心肌产生保护作用。

图4 XSB抑制HF大鼠氧化应激和炎症反应。（A）通过生化试剂盒检测的氧化应激相关分子，包括T-AOC和GSH-Px，n=8。（B）基于Luminex技术的多重系统测定血清炎性细胞因子。n＝6。 数据表示为平均值±标准差。 *与假手术组相比，p<0.05和**p<0.01；与HF组相比，#p＜0.05和##p＜0.01。

4.蛋白质组学分析表明XSB治疗HF的靶点

蛋白质组学结果显示，从9个样品中总共定量了3671个蛋白质。与假手术组相比，HF组的342和38种蛋白质分别显著增加和减少。我们还发现，与HF组相比，XSB组有68个DEPs，其中9个上调，59个下调。共有55个共同DEPs在两种类型的比较中显示出变化。

在XSB组和HF组之间获得了关于结构域BP、CC和MF的GO富集分析项（图5A）。BP术语主要与细胞外基质组织、细胞外结构组织、外部封装结构组织、胶原原纤维组织、纤溶酶原激活的调节、凝血、止血、超分子纤维组织、纤维蛋白原激活和转化生长因子β产生的调节有关。KEGG富集分析表明DEPs相关信号通路与补体和凝血级联反应、心肌收缩、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、肌动蛋白细胞骨架调节、谷胱甘肽代谢、TGF-β信号通路、其他聚糖降解、氧化磷酸化和心肌细胞中的肾上腺素能信号传导有关（图5B）。

为了进一步研究XSB对HF的可能治疗靶点，构建了两个PPI网络（图5C）。一种重叠蛋白聚糖（DCN）被筛选出参与这两个网络。根据KEGG富集分析，DCN可能与TGF-β信号通路有关。此外，通过蛋白质印迹验证DCN的表达。正如预期的那样，与假手术组（0.37±0.07）相比，HF组的DCN表达增加（0.23±0.01），而与HF组相比，XSB处理组的表达减少（0.4 g/kg，0.14±0.04；0.8 g/kg，0.09±0.02）（图5D）。DCN表达的趋势与定量蛋白质组学分析中观察到的趋势相似。

图5 基于TMT的定量蛋白质组学检测到的XSB调节的DEPs的功能分析。（A）基于BP、CC和MF类别的DEP的GO富集分析。（B）KEGG富集分析揭示了前10个信号通路。（C）两个PPI网络分析构建的不同对比。（D）通过蛋白质印迹检测XSB对心脏组织中DCN表达的验证。n＝3。 数据表示为平均值±标准差。与假手术组相比，**p<0.01；与 HF组相比，##p＜0.01。

5. XSB通过抑制凋亡、炎症和氧化应激来保护H9c2细胞免受OGD

为了进一步探讨XSB对HF的保护机制，体外建立了OGD诱导的H9c2细胞损伤模型。进行CCK-8测定以确认XSB的肠道吸收液是否对H9c2细胞具有保护作用。与OGD组的存活率53.99±1.84%相比，30、60和120μg/mL剂量的存活率分别为64.93±2.40%、70.69±5.47%和80.01±2.62%，表明XSB预处理提高了存活率（图6A）。流式细胞术结果表明，OGD能显著诱导H9c2细胞凋亡，凋亡率为36.11±3.42%。XSB有效抑制OGD诱导的细胞凋亡，30、60和120μg/mL剂量下的细胞凋亡率分别为23.49±4.05%、17.90±3.45%和13.48±2.52%（图6B和C）。此外，OGD通过降低超氧化物歧化酶（SOD）水平和增加乳酸脱氢酶（LDH）和丙二醛（MDA）水平来增加氧化应激。XSB预处理通过提高SOD水平和降低LDH和MDA水平来抑制氧化应激（图6D）。此外，与对照组相比，OGD组的炎性细胞因子水平（包括IL-1β、IL-6和TNF-α）升高。相反，由于XSB预处理，IL-1β、IL-6和TNF-α的水平降低（图6E）。我们的研究结果表明，XSB通过抑制细胞凋亡、炎症和氧化应激来保护H9c2细胞免受OGD诱导的损伤。

图6 XSB抑制OGD诱导的H9c2细胞的凋亡、炎症和氧化应激。（A）CCK-8法测定XSB肠吸收液的细胞活力。n＝9。（B）不同组的代表性流式细胞术图像。（C）流式细胞术测定XSB肠吸收液的细胞凋亡率。n＝3。（D）用生化试剂盒检测细胞氧化应激相关分子如SOD、MDA和LDH。n＝9。（E）ELISA监测培养上清液中的炎症细胞因子，包括IL-1β、IL-6和TNF-α。n＝10。 数据表示为平均值±标准差。与对照组相比，**p<0.01；与O GD组相比，#p＜0.05和##p＜0.01。

6. XSB通过调节DCN/PPARα/PGC-1α/P300信号通路，促进OGD诱导的H9c2细胞线粒体能量代谢

动物蛋白质组学研究结果表明，XSB可能调节DCN的表达，DCN是一种与能量稳态相关的抵抗素受体。因此，评估腺苷核苷酸的含量和相关DCN/PPARα/PGC-1α/P300信号通路的表达，以评估XSB对线粒体能量代谢的影响。与对照组相比，OGD组的ATP、ADP和AMP三种腺苷含量明显降低。相反，与OGD组相比，高剂量XSB预处理组的含量均显著增加（图7A）。与对照组相比，OGD组DCN的表达增加，而PPARα、PGC-1α和P300的表达减少。与OGD组相比，XSB预处理组DCN表达下降，PPARα、PGC-1α和P300表达增加（图7B）。这些数据表明，XSB通过调节DCN/PPARα/PGC-1α/P300信号通路，增强了OGD诱导损伤的H9c2细胞的线粒体能量代谢。

图7 XSB增强OGD诱导的H9c2细胞的线粒体能量代谢。 （A）通过HPLC分析测定腺苷核苷酸如ATP、ADP和AMP的含量。n＝4。 （B）免疫 印迹法检测DCN/PPARα/PGC-1α/P300信号通路的表达。n＝3。数据表示为平均值±标准差。与对照组相比，*p<0.05和**p<0.01；与 OGD相比，#p＜0.05和##p＜0.01。

我们的研究阐明了XSB在HF治疗中的保护作用和潜在机制。首先，我们进行了经胸超声心动图、多种染色方法和透射电子显微镜检查，以评估XSB对HF大鼠的保护作用。我们还进行了实验测试，以检测血清生物标志物的水平，如NT-proBNP、BNP和ST2，以及血浆氧化应激和炎症相关分子的水平。通过定量蛋白质组学筛选，DCN是HF发病机制和XSB治疗的关键分子。此外，建立了OGD诱导的H9c2细胞损伤，以进一步研究XSB对HF的治疗机制。CCK-8法和流式细胞术分别测定细胞存活率和凋亡率。测定细胞氧化应激相关分子如SOD、MDA和LDH的水平，以及上清液中炎性细胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。基于DCN与能量代谢之间的潜在关系，检测了腺苷ATP、ADP和AMP的含量以及DCN/PPARα/PGC-1α/P300通路的表达。动物和细胞实验均证明，XSB可有效抑制因血供不足引起的心肌损伤加重。

越来越多的证据表明，氧化应激和炎症在HF的病理生理变化和疾病进展中起着重要作用。心肌线粒体功能障碍是HF的标志，也是氧化应激的主要原因，氧化应激会导致随后的炎症和心脏损伤。氧化应激产生的过量活性氧（ROS）可能导致心肌细胞凋亡、炎症反应和微血管内皮失衡。在小鼠中，ROS的增加损害了心肌的收缩和舒张功能，导致左心室重构。在HF动物模型中，除了氧化应激相关分子水平增加外，还观察到抗氧化防御系统产生的SOD、过氧化氢酶和GSH水平显著降低。ROS通过多种途径募集炎症细胞，如趋化因子的上调、中性粒细胞的激活和粘附分子的表达。

图8 XSB通过DCN/PPARα/PGC-1α/P300途径改善HF心肌损伤的示意性作用

参与HF发生的细胞因子和趋化因子主要包括TNF-α、TGF-β、IFN-γ、MCP-1、MIP-1α和ILs。炎症导致微血管内皮功能障碍，改变心肌细胞和心肌微循环之间的串扰。增强的氧化应激和炎症触发因素会影响心脏功能，有助于HF的症状进展和预后意义。因此，氧化应激和炎症反应之间的平衡至关重要，因为它决定了生理（保护）或病理（损伤）反应的总体反应。关于HF中氧化和炎症机制的更具体和平衡的抑制的干预措施应该进一步研究。我们的结果表明，在动物实验中，XSB增加了T-AOC和GSH-Px的活性，并降低了血清细胞因子的水平，包括GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-6、TNF-α和VEGF。同时，在细胞实验中，XSB提高SOD活性，降低LDH和MDA活性，降低IL-1β、IL-6和TNF-α水平。我们的累积数据表明，XSB通过抑制氧化应激和炎症反应来减轻心肌损伤。

心肌细胞分泌的循环BNP和NT-proBNP水平通常较低，但由于HF患者的体积或压力过载，其水平可能显著升高。BNP和NT-proBNP水平用于诊断HF、评估药物治疗效果和预测临床结果，这与HF患者的较差预后呈正相关。循环可溶性ST2是IL-1受体家族的成员，是与心肌肥大、心室功能障碍和心肌纤维化相关的机械应激的分子生物标志物。血清ST2水平升高大大增加了急性和慢性HF心血管结局的风险。生物化学标志物如BNP、NT-proBNP和ST2对于心血管疾病的诊断、监测和治疗是重要的。大量证据表明，它们的预后和诊断价值在结合使用时大大提高。因此，预防这些心血管风险因素对于降低HF严重程度至关重要。在本研究中，ST2水平升高和Masson染色均提示HF大鼠心肌纤维化的发生。XSB通过降低血清BNP、NT-proBNP和ST2水平来恢复心脏功能并抑制心肌纤维化，从而改善HF预后。

为了进一步筛选XSB对HF的治疗靶点，通过定量蛋白质组学选择DCN作为候选标志物，并通过蛋白质印迹进行验证。DCN表达的变化与定量蛋白质组学分析的结果高度一致。DCN是一种普遍存在的硫酸软骨素蛋白聚糖，属于富含亮氨酸的小蛋白聚糖基因家族。DCN可以调节多种生物功能，如炎症、肌生成、纤维化、氧化应激、胶原纤维生成和伤口愈合。研究表明，DCN对心血管疾病具有重要的保护作用；因此，它可以成为一个可能的治疗靶点。心肌梗死后7天，梗死区DCN的表达显著增加。当DCN与细胞表面的分子或受体结合时，它可能随后调节内皮细胞和肌成纤维细胞的增殖，减少TGF-β依赖性纤维化，并保护心肌细胞免受缺血性损伤。DCN对体外缺血/再灌注损伤具有直接的心脏保护作用，不依赖于NO-cGMP-PKG和TLR4信号通路。DCN缺乏对MI后组织瘢痕的正确形成产生不利影响。DCN通过CaMKII/MEF-2信号通路抑制应激诱导的心肌肥大。DCN是一种支架蛋白，通常支持心脏的完整性；然而，在病理条件下，其可溶性DCN可以在血液循环中释放，这是一个危险因素。例如，急性冠状动脉综合征患者的血清DCN水平升高，这对缺血性心脏病炎症反应的增加有积极作用。

尽管线粒体在病理条件下的能量相关功能中发挥着至关重要的作用，但关于HF中DCN与线粒体能量代谢之间的直接关系，已有一些报道。例如，乳腺癌细胞中的DCN-Met相互作用通过PGC1a介导的线粒体自噬维持线粒体稳态。DCN通过抑制Akt/mTOR/p70S6K通路促进促自噬AMPK信号级联并抑制抗自噬信号，然后在内皮细胞中诱导自噬。线粒体是产生能量的重要细胞器，通过氧化磷酸化将各种能量底物转化为ATP。氧化磷酸化和自噬之间存在着密切的联系，自噬与能量产生的改变有关。根据上述已发表的报道，我们继续进行细胞实验，分析DCN可能负责OGD诱导损伤的心肌细胞的线粒体能量代谢。

心肌能量代谢紊乱在HF的进展和恶化中起着至关重要的作用。改变心脏能量代谢可以改善左心室功能，治疗HF。心肌代谢作为HF的一种治疗选择，已经引起了全球研究者的关注。过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）是核受体超家族的三种亚型之一，调节心脏能量代谢和心肌病理重塑。PGC-1α是PPARα的共激活因子，可通过与PPARα结合促进线粒体生物发生并增强脂肪酸氧化。P300是PPARα和PGC-1α组合的转录产物，是转录的关键激活剂。研究表明，P300调节PPARα/PGC-1α的激活并参与心脏的病理发展。PPARα/PGC-1α复合物调控参与心脏能量代谢和线粒体生物发生的酶的表达，这与心肌重塑有关。由于PPARα和PGC-1α水平的升高可以增加ATP的产生，并改善心脏功能，我们专注于确定与线粒体能量代谢相关的PPARα/PGC-1α/P300信号通路的水平。细胞实验结果表明，XSB通过激活PPARα/PGC-1α/P300信号通路，增加了OGD诱导的ATP、ADP和AMP三种腺苷的水平，并促进了能量代谢。这些数据表明，XSB可能通过DCN介导的信号通路调节线粒体能量代谢，但具体机制仍需进一步研究。

糖尿病性心肌病（DC）是糖尿病（DM）诱导的心脏病的一种特殊形式，其特征是左心室肥大和舒张功能障碍，最终导致HF。越来越多的证据表明，DC的发展与多种因素有关，如胰岛素抵抗、内皮功能障碍、心脏顺应性降低、氧化应激增加、离子通量异常和冠状动脉微循环异常。由于DC在病理生理特征上与缺血性心肌病（ICM）有一定的潜在相似性，XSB可用于DC的治疗。临床评估和实验研究证明了中草药化合物作为HF有效治疗药物的前景。最近，一些用于治疗糖尿病和心脏病的新分子被发明出来，以改善疾病结果并带来有益效果。因此，应分离和筛选来源于XSB的活性成分，作为DC或ICM的潜在候选治疗药物。此外，还需要进一步探索XSB的更多化学和力学研究，以开发HF的预防和治疗方法。

结论

我们的研究表明， XSB治疗可以有效改善心脏功能，减轻心肌损伤，并抑制体内对HF的氧化应激和炎症反应。 此外， XSB预处理可显著抑制细胞凋亡、炎症和氧化应激，增强线粒体能量代谢，从而保护细胞活力免受OGD的影响。XSB的保护机制与DCN/PPARα/PGC-1α/P300信号通路密切相关（图8）。 我们的研究结果为通过调节 DCN相关信号通路开发HF疗法提供了参考，并提供了使用强效替代草药XSB对抗心血管疾病的治疗潜力的信息 。

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0753332223010764?via%3Dihub

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