实现大量CAR-T细胞的高效制备，武大团队研发等渗电转手段，为非病毒递送构建CAR-T的临床转化奠定基础

自 2017 年 CAR-T 细胞免疫疗法（下称“CAR-T 疗法”）被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准作为第一个用来治疗白血病的细胞疗法以来，全球已经有 8 款 CAR-T 产品获批上市。

其中，中国国家药品监督管理局批准上市了两款，分别为奕凯达和倍诺达；FDA 批准了 6 款，分别为 Kymirah、Yescarta、Tecartus、Breyanzi、Abecma、Carvykti。

这些产品可用于治疗急性淋巴白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤等恶性血液肿瘤。整体来看，CAR-T 疗法在治疗恶性血液病方面取得了突破性疗效，并为治疗实体瘤开辟了新的可能性。

迄今为止，已知的所有获 FDA 批准商业化的 CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy）疗法，都是使用 γ- 逆转录病毒载体或慢病毒载体进行递送。

然而，目前使用的病毒递送系统存在一些潜在限制，比如存在病毒随机嵌合基因组所带来的安全隐患、基因表达稳定性不足、免疫原性、生产成本较高等。

为了克服这些挑战，学界正在积极研究开发非病毒递送方法，以期提高 CAR-T 疗法的治疗效果。

其中，利用电转 CRISPR/Cas9 系统和编码 CAR的 dsDNA 模板来构建 CAR-T 疗法，是被研究得最为广泛的方法。

但是，多支科研团队发现，电转 dsDNA 会造成严重的原代 T 细胞死亡，因此需要经过流式分选富集编辑后的活细胞，这极大限制了由非病毒递送系统构建的 CAR-T 疗法在临床上的广泛应用。

当下，制备 CAR-T 的主要方法，是利用慢病毒递送 CAR 载体进入免疫细胞。截止到现在，已有 8 款由慢病毒载体制备的 CAR-T 产品进入市场。 慢病毒制备涉及到病毒规模化生产，制造成本很高，这导致每个产品的单价都在 100-300 万不等。比如，2021 年 120 万一针的 CART 抗癌药就曾引起网友热议，这是一个普通家庭很难承受的价格。

除此之外，当慢病毒进入细胞后，就会随机嵌入基因组之中，由于每个细胞嵌入的基因组位点均不一样，因此存在表达不均一和随机嵌入所带来的安全性风险。

相比慢病毒载体，非病毒递送系统具有许多优势。非病毒递送系统包括三个成分：Cas9、gRNA、以及编码 CAR 的双链 DNA。

通过 Cas9 和 gRNA 在基因组的特定位点切割，非病毒递送系统能将 CAR 精准整合到基因组特定位点。在非病毒递送过程中，由于不涉及病毒的使用，因此可以避免病毒发挥毒性。

同时，非病毒构建 CAR-T 时所需要的 Cas9 蛋白、sgRNA、以及编码 CAR 的 DNA 模板均易制备和量产，故能极大简化 CAR-T 制备的成本和时间。

在基因组特定位点精准嵌入 CAR，可以实现更高和更稳定的表达，这也是 CAR-T 疗法获得成功的关键因素之一。

除此之外，使用非病毒递送 CRISPR/Cas9 构建 CAR-T，既能实现定点整合 CAR、避免随机插入的风险，又能同时调控内源性基因比如 TRAC、B2M、PD1 等。

虽然非病毒递送更加简单高效，但是现有电转递送双链 DNA 的方法，常常伴随大量细胞毒性，这会导致免疫细胞的死亡，以至于无法高效制备 CAR-T 细胞。

如何高效地制备大量 CAR-T 细胞

基于此，武汉大学医学研究院教授和合作者希望能够解决电转递送 DNA 所产生的细胞毒性。在近期一项工作中，在研究产生细胞毒性的分子机制之后，他们证明电转 DNA 诱导原代 T 细胞死亡的原因，在于激活了 cGAS-STING 通路。

图 | 张楹（来源：）

其还发现，改变电转缓冲液的渗透压，可以调控上述通路的激活。利用等渗电转缓冲液可以显著降低 cGAS-STING 激活程度，进而提高 T 细胞活力。

相较于商业电转，等渗电转制备出的 CAR-T 细胞高出 20 倍之多，从而能为非病毒递送构建 CAR-T 的临床转化研究奠定基础。

除此之外，由于 T 细胞不具备调节自身细胞大小的能力，很容易受到环境渗透压影响。而等渗环境可以促进电转产生的膜孔融合，从而提高电转后的细胞活力和增殖。

研究中，等人通过揭示电转 DNA 导致细胞毒性的分子机制，进而寻求调控 cGAS-STING 通路的方法，最终降低细胞的毒性。他们发现电转 DNA 导致的细胞毒性，是源于激活了细胞内的天然免疫通路 cGAS-STING。

由于 STING 的小分子抑制剂和 siRNA 均存在自身局限性，无法有效恢复电转 DNA 所来带的细胞毒性。于是，他们另辟蹊径从电转入手，利用高通量筛选来提高 DNA 递送效率和细胞活力的缓冲液。

在筛选几百种电转条件之后，课题组发现电转缓冲液 B1mix 可以显著降低 cGAS-STING 通路的激活，从而提高 DNA 的递送效率和细胞活力。进一步地，他们又对电转机制进行研究，结果发现电转缓冲液的渗透压，可以直接调控 cGAS 与 dsDNA 的结合亲和力，进而调节 cGAS-STING 激活。

与此同时，等渗电转缓冲液可以极大降低上述通路的激活和细胞死亡，从而实现 CAR-T 细胞的高效制备。

事实上，电转递送是一个很成熟的领域，针对它的相关研究主要集中在 20 世纪 90 年代以前。而该团队通过在成熟领域里寻找创新点，揭示了电转缓冲液的渗透压可以调控细胞内的分子互作作用。

其还证明通过改变电转缓冲液可以显著提高 CAR-T 制备，在机制上揭示了渗透压这一影响递送的关键因素，为调控 cGAS-STING 通路的激活打开了新思路。

此外，在造血干细胞以及小鼠 T 细胞中，这种新的电转方法均能提高它们的递送效率，这对于其他领域的研究也非常有价值。

（来源：Nature Biomedical Engineering）

三次补充实验与上百种电转缓冲液

据介绍，论文从第一次投稿到接收，前后累计补充 3 次实验。每一次审稿人的意见都会给他们带来不同的启发。在第一轮审稿意见中，两位审稿人都提出同一个问题：新电转缓冲液促进 DNA 入核的机制是什么？

为回答这个问题，课题组解析了电转过程中的每一个步骤，并从不同的角度去研究，比如膜融合过程、电转缓冲液的成分、理化性质等。

为了探索是否存在某种成分直接影响 DNA 递送，他们将电转缓冲液的成分进行逐一删减或逐一增加，借此配制成新的电转缓冲液。

表示：“这是一个巨大的工作量，我们前后一共试了上百种电转缓冲液，最终发现电转缓冲液的渗透压起着至关重要的作用，与具体的成分无关。”

（来源：Nature Biomedical Engineering）

而在发现渗透压这个关键因素后，他们分别从生化、细胞、遗传三个角度对其进行深入剖析。

在生化实验上，该团队证明 cGAS 蛋白和 DNA 的亲和力会受到溶液渗透压的影响。随着渗透压偏离等渗范围，cGAS 和 DNA 的结合力显著增加，这可以促进 cGAS 的酶活力，从而催化产生大量的 2’3’-cGAMP。

在细胞层面上，他们通过将细胞在不同渗透压的溶液里进行短暂孵育，分别测量细胞大小、容积和胞内渗透压，结果发现细胞大小、容积和胞内渗透压，都会随着环境渗透压的变化而发生相应的改变。当渗透压偏离等渗时，细胞内由 cGAS 催化产生的第二信号分子 2’3’-cGAMP 也会随之增高，cGAS-STING 通路的下游相关基因 IFNB1、 ISG56 和 IP10 也会随之升高，细胞死亡也会随之增多。

在遗传层面上，他们在 cGAS 敲除或 STING 敲除的小鼠 T 细胞中，验证了渗透压通过作用于 cGAS-STING 这个分子通路影响 DNA 递送和细胞死亡，借此提供了遗传学证据。

与慢病毒递送构建的 CAR-T 细胞相比，利用等渗电转缓冲液构建的 CAR-T 细胞，在释放细胞因子时具备更强的能力，在小鼠荷瘤模型中的杀肿瘤效果更好，小鼠的存活率相较于慢病毒方法制备的 CAR-T 提高了近 2 倍。

目前，已有论文报道称非病毒递送构建 CAR-T 细胞已经进入临床试验，并已取得良好的治疗效果，这说明非病毒递送构建 CAR-T 具备安全性和有效性。

然而，直接电转存在一定的细胞毒性，导致一部分患者的细胞由于过于敏感的原因，无法制备足够多的 CAR-T 细胞。

如果将等渗电转缓冲液用于临床级 CAR-T 细胞的制备上，再辅助 DNA 末端修饰，预计可以提高 CAR-T 的产量，从而取得更好的治疗效果。

在实际操作中，电转缓冲液是由一组成分明确的小分子化合物和糖类组成。由于成分明确、原料容易获取，故能快速制备生产级别的等渗缓冲液。

最终，相关论文以《通过渗透抑制 DNA 传感 cGAS–STING 途径增强 DNA 电穿孔 T 细胞的活力》（）为题发在 Nature Biomedical Engineerin（IF 28.1），安静是第一作者，和同学院的教授担任共同通讯。

图 | 相关论文 （来源：Nature Biomedical Engineering）‍

论文发表后，课题组收到来自业界的大量咨询，目前他们正和业界积极合作探索转化的可能。

细胞治疗产业蓬勃发展，据估计到 2030 年全球细胞产业可以达 600 亿美金。截止到 2022 年，已有 57 项基因编辑的细胞疗法进入临床实验，包括肿瘤免疫（38 项）、地中海贫血症（15 项）和糖尿病（4 项）。

这些细胞疗法可以通过电转递送基因编辑工具，通过增强细胞功能达到疾病的治疗。

而本次的电转方法不仅可以提高 DNA 递送效率，也可以在多种原代细胞中提高 mRNA 和蛋白的递送效率，因而在细胞治疗领域有着极大的应用前景。

利用这一递送方法，在降低原料用量的同时，并不会影响递送的效率和稳定性，这能助力于实现降本增效，进一步推动细胞治疗产业的发展。

同时，本次研究还发现电转缓冲液除能提高 DNA 递送效率之外，对于 mRNA 和蛋白的递送效率也可以显著提高。后续，他们将继续改进配方，希望能在现有基础之上将 mRNA 的递送效率再次提高 2-4 倍。同时，他们也正在开展机制解析，以期可以解决 mRNA 递送的问题。

参考资料：

1. An, J., Zhang, CP., Qiu, HY. et al. Enhancement of the viability of T cells electroporated with DNA via osmotic dampening of the DNA-sensing cGAS–STING pathway. Nat. Biomed. Eng (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-023-01073-7

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