人母乳可逆转新生小鼠白质损伤的机制

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80%的早产存活婴儿患有严重的神经系统损伤，是弥漫性白质损伤（White matter injury，WMI）的高风险人群，WMI会导致脑瘫进而影响运动、认知、社会行为和神经感觉。尽管该问题非常严重，但目前还没有有效的治疗方案。孕后第23~32周是WMI发生的高风险时期，即髓鞘形成之前的白质发育阶段。在这段时间里，胎儿大量产生的前少突胶质细胞（Pre-oligodendrocyte，pre-OL）为髓鞘化少突胶质细胞提供细胞来源。由于pre-OL缺乏抗氧化酶，所以pre-OL很容易受到炎症和氧化应激的影响而发生变性，因而神经性病变优先与正在发育的白质有关。不过，存在于新生儿生发基质内丰富的神经干/祖细胞（Neural stem/progenitor cell，NSPC）为其损伤修复提供了机会。针对在发育过程中减少的pre-OL开发治疗方法，可能会为改善新生儿WMI提供帮助。

氧甾醇（Oxysterols）作为内源性氧化胆固醇的一种，已在哺乳动物的血液、大脑和胎盘中检测到，但其组织特异性功能尚不清楚。研究发现氧甾醇是shh（Sonic hedgehog，shh）通路的激活剂，而shh通路是少突胶质细胞命运决定的调节因子，并增强成人脱髓鞘模型损伤后的髓鞘再生。因此，氧甾醇对shh信号传导的可能影响新生儿发生WMI后调节少突胶质细胞的形成。

近日，来自美国杜克大学医学中心的Eric J. Benner课题组在Cell Stem Cell期刊发表题为20-aHydroxycholesterol, an oxysterol in human breast milk, reverses mouse neonatal white matter injury through Gli-dependent oligodendrogenesis的研究论文，他们在人类母乳中发现了一种内源性氧甾醇——20-α羟基胆固醇（20-αHydroxycholesterol，20HC），它通过shh通路、Gli家族基因依赖性机制诱导少突胶质细胞的发生，为减轻早产引发WMI提供了一种潜在的治疗方法。

通过对健康足月分娩母亲2个月内母乳的分子质谱鉴定，研究者在母乳中检测到多种侧链修饰的氧甾醇，包括20HC、22-羟基胆固醇（22HC）、24-羟基胆固醇（24HC）、25-羟基胆固醇（25HC）和27-羟基胆固醇（27HC）。这表明母乳喂养的新生儿可以经常接触到多种氧甾醇，并且没有已知的不良后果。

研究者在EGF和FGF的体外环境下培养NSPC，再用不同氧甾醇对NSPC处理24小时后移除EGF和FGF，进而观察分化产生少突胶质细胞（CNPase+MBP+细胞）的情况。结果发现，20HC增加了少突胶质细胞的数量，而27HC则没有这种效果。

为了进一步确定20HC是改变了未分化NSPC的细胞命运还是增强了少突胶质细胞祖细胞（Oligodendrocyte progenitor cell，OPC）的增殖，研究者分别在3个时间点（移除EGF和FGF前24小时、移除EGF和FGF的时刻、移除EGF和FGF后6天）在NSPC培养体系中加入20HC，随后观察少突胶质细胞的数量。结果发现，当在移除EGF和FGF前加入20HC，能够产生最多的少突胶质细胞，这表明20HC是靶向未分化NSPC的。此外，研究者还从新生小鼠中分离了原代OPC，通过细胞培养发现20HC处理的细胞没有增加OPC的增殖水平。以上结果表明，20HC不会诱导OPC增殖，而是通过改变NSPC的命运以增加少突胶质细胞的数量（如图1所示）。

图1. 20HC是改变未分化NSPC向少突胶质细胞转变的命运

为了更好地了解20HC体外处理后NSPC培养物中发生了哪些通过膜结合受体及其可溶性配体的信号串扰，研究者使用了单细胞转录组测序和细胞间通讯分析。结果发现FoxJ1+室管膜细胞产生PDGF和OPC上PDGFRα通路的激活，而且20HC治疗增加了血小板反应蛋白（THBS）通路内的NSPC信号传导，该通路与Notch信号传导有关。

在影响NSPC命运转变为少突胶质细胞的分子通路中，shh信号传导是研究最充分的通路，所以接下来研究者探讨了shh信号在氧甾醇诱导少突胶质细胞发生中的作用。通过体外使用shh处理NSPC，研究者观察到少突胶质细胞数量增加。由于Gli1和Gli2是shh通路的下游转录因子，因此研究者也构建了转基因小鼠模型验证Gli1和Gli2的功能。在新生幼崽缺失Gli2时，不会破坏新生幼崽固有的少突胶质细胞的产生；然而，当使用20HC刺激时，Gli2缺陷的NSPC并没有增强其向少突胶质细胞的命运转化。此外，为了确定Gli2缺陷的少突胶质细胞在功能上是否正常，研究者又以甲状腺激素T3（少突胶质细胞成熟诱导剂）处理了来自Gli2缺陷小鼠的NSPC，结果发现Gli2缺陷小鼠和野生型小鼠产生的少突胶质细胞同样复杂和成熟。这些结果表明，敲除Gli2会损害20HC诱导少突胶质细胞的命运转化，但不会影响其他内源分子（如T3）促进其分化为成熟少突胶质细胞的能力。

坏死性小肠结肠炎或自发性肠穿孔是在早产儿中常见的与WMI相关疾病。研究者构建了新生儿肠穿孔炎性脑损伤模型，发现和对照组相比，脓毒症可以诱发小鼠胼胝体扩散性增加、细胞结构丧失、少突胶质细胞和OPC数量减少、凋亡OPC数量增加、髓鞘形成减少。当使用20HC治疗脓毒症小鼠之后，其体内的OPC和少突胶质细胞数量均出现明显增加，并且脑室周围和皮质下白质的髓鞘形成也得到了明显的改善；但是，和未经治疗的脓毒症小鼠相比，凋亡OPC的数量没有发生明显变化，这表明20HC治疗不会改变损伤后的细胞死亡。此外，研究者还运用步态分析系统以评估20HC治疗后的运动结果，发现脓毒症小鼠表现出显著降低的规律性指数（是指肢体间协调性和运动规划的衡量标准），而用20HC治疗的小鼠则纠正了规律性指数的缺陷。以上这些结果表明，20HC治疗可以挽救新生儿炎症性白质损伤，而且20HC可以改善新生脓毒症小鼠的神经系统和运动功能，并持续到成年期。

总之，该研究在母乳中识别了能刺激少突胶质细胞生成潜力的内源性氧甾醇，为提供具有安全性的婴儿治疗方案奠定了重要基础。

https://doi.org/10.1016/j.stem.2023.07.010

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