FSHW | 王兆升教授等：皱皮木瓜多酚提取物抑制NF-κB和MAPK信号途径减轻脂多糖诱导的RAW264.7巨噬炎症反应

Introduction

炎症是身体组织的常见生物反应，作为对有害刺激和微生物入侵者（例如刺激物、受损细胞或传染性病原体）的防御/愈合过程，甚至会在没有感染或由于组织压力和功能障碍导致的明显组织损伤的情况下发生。炎症，尤其是长期/慢性炎症，会导致一系列疾病，包括牙周病、炎症性肠病、骨关节炎、癌症、II型糖尿病、脂质代谢紊乱、慢性阻塞性肺病和神经系统相关疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）。当炎症发生时，多种炎症介质、趋化因子、细胞因子和活性氧（ROS）被激活，如一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素（IL-1β）、IL-6、IL-8、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧合酶（COX-2）和其他一些免疫细胞。核因子-κB（NF-кB）信号通路是炎症反应中的关键转录因子，通常情况下，存在于细胞质中，处于不活跃的状态。当受到外界刺激后，激活的NF-κB会转移到细胞核中，结合靶DNA并诱导基因的表达，引起炎症反应。研究发现，MAPK信号通路与NO及促炎因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6）的产生也密切相关，它在调节细胞生长和分化中起着至关重要的作用，同时可以调控细胞对外源性和环境的应激反应，从而调节LPS刺激的巨噬细胞的炎症反应。因此，减轻炎症反应对于维持局部和全身稳态以及维持人类健康至关重要。

巨噬细胞是宿主防御外来病原体的关键角色。刺激物（例如脂多糖（LPS））激活巨噬细胞，导致产生ROS、促炎细胞因子和炎症介质。产生的NO可以与超氧自由基诱导的亚硝化应激结合形成活性氮物质（RNS），导致氧化还原失衡和炎症负荷增加。由于炎症和氧化应激是相互关联的过程，因此针对炎症状况/疾病的有效治疗方法包括监测自由基和炎症介质。酚类化合物具有抗炎活性，这可能与它们对酶和信号系统的影响以及它们作为抗氧化剂的作用有关。

皱皮木瓜（Chaenomeles speciosa (sweet) Nakai），属于蔷薇科木瓜属植物。皱皮木瓜含有糖类、蛋白质、脂肪、维生素和矿物质等多种营养成分，同时还含有多酚、黄酮、多糖、皂苷、萜类化合物等多种活性成分，具有抗氧化、抗炎、抑菌、抗肿瘤、镇痛等作用。尽管皱皮木瓜已被用于治疗炎症，但其酚类化合物抗炎作用的分子机制尚未完全阐明。因此，本文通过HPLC-Q-TOF-MS/MS对皱皮木瓜纯化多酚提取物进行成分分析，并探究了其抗炎能力及潜在的分子机制，可为皱皮木瓜深加工利用提供理论基础。

Results and Discussion

皱皮木瓜纯化多酚提取物中关键酚类化合物的分析

通过UPLC-Q-TOF-MS/MS对皱皮木瓜纯化多酚提取物的成分进行了定性分析，结果发现纯化多酚提取物中主要含有9种化合物（图1A-B），其中峰5、7和8的含量较多，为皱皮木瓜纯化多酚提取物中的关键化合物。HPLC结果证实了峰5、7和8分别为原花青素B1、儿茶素和绿原酸，与MS2谱图鉴定结果一致（图1C）。3种关键酚类化合物的校准曲线均表现出良好的线性关系（R2≥0.9992），含量大小为绿原酸>原花青素B1>儿茶素（表1），其含量之和约为141.70 mg/g，其中绿原酸在皱皮木瓜纯化酚类提取物中的含量最高。

（A）正负离子模式下的总离子色谱图（TIC）和HPLC图（280 nm）；（B）MS2光谱和原花青素B1、儿茶素、绿原酸在负离子模式下的裂解途径。符号★表示母离子，[M−H]−；（C）皱皮木瓜纯化多酚提取物及原花青素B1、儿茶素和绿原酸标准品的HPLC色谱图（280 nm）。

图1皱皮木瓜纯化多酚提取物的成分分析

表1皱皮木瓜纯化多酚提取物的UPLC-Q-TOF-MS/MS分析

皱皮木瓜纯化多酚提取物抗炎作用检测

由图2A可以看出，浓度小于30 μg/mL的皱皮木瓜纯化多酚提取物处理细胞时，细胞存活率均在90%以上，未观察到细胞毒性。NO含量随着LPS浓度的增大而增大，当LPS高于0.8 μg/mL时，NO含量基本不变甚至开始出现下降趋势（图2B）。与NC组相比，0.8 μg/mL LPS刺激显著提高了NO含量，表明LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型造模成功（图2C-D）。与模型组相比，皱皮木瓜纯化多酚提取物预处理2 h与共处理24 h下，5 μg/mL皱皮木瓜多酚提取物对NO的抑制率均没有显著差异，而10～30 μg/mL皱皮木瓜纯化多酚提取物均能显著降低NO含量，且共处理24 h的效果好于预处理2 h。如图2E所示，不同浓度皱皮木瓜纯化多酚提取物可有效阻止细胞分化，使其形态好转。当浓度达到30 μg/mL时，大部分细胞形态接近正常组状态。

（A）对细胞活力的影响；（B）LPS浓度对NO的影响；（C）纯化多酚提取物和LPS共处理24 h对NO的影响；（D）纯化多酚提取物预处理2 h对NO的影响；（E）纯化酚提取物和LPS共处理对RAW264.7细胞形态的影响。

图2皱皮木瓜纯化多酚提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞损伤的影响

LPS刺激显著提高了TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，而皱皮木瓜纯化多酚提取物以剂量依赖性方式抑制了LPS诱导下促炎因子的增加，30 μg/mL皱皮木瓜多酚提取物的抗炎作用最显著，使TNF-α、IL-1β和IL-6的表达分别下降66.31%、71.09%和66.67%（图3A）。如图3B所示，iNOS和COX-2的mRNA表达随着皱皮木瓜多酚提取物浓度的增大而下降，当皱皮木瓜多酚提取物浓度为30 μg/mL时，iNOS和COX-2的mRNA表达下降幅度最大。图3C所示，30 μg/mL皱皮木瓜多酚提取物使iNOS和COX-2的蛋白表达下降幅度最大（分别为81.06%和63.09%），这一结果与上述mRNA的表达规律一致。

（A）TNF-α、IL-1β和IL-6；（B）iNOS和COX-2的mRNA表达（C），iNOS和COX-2的蛋白表达。

图3皱皮木瓜纯化多酚提取物对LPS诱导的RAW 264.7细胞损伤的影响

皱皮木瓜纯化多酚提取物抗炎机制探究

在炎症反应中，多种信号转导通路都会被激活，其中NF-κB信号通路是关键的通路之一。如图4A所示，皱皮木瓜多酚提取物通过抑制IκBα、p65蛋白的磷酸化，抑制炎症下游基因的表达，进而达到抗炎的效果。如图4B所示，NC组的NF-κB p65主要分布在细胞质中，而LPS刺激促进了NF-κB p65从细胞质向细胞核的转移。与模型组相比，皱皮木瓜多酚提取物可以抑制NF-κB p65的核转移，从而发挥抗炎作用。

皱皮木瓜多酚提取物除了通过NF-κB信号通路外，还可以通过调节MAPK信号通路减轻RAW 264.7细胞的炎症损伤，结果如图4C所示，LPS刺激显著提高了p38和JNK两种蛋白的磷酸化水平；相较而言，皱皮木瓜多酚提取物的处理能够有效抑制LPS刺激下p-p38和p-JNK蛋白的表达，进而达到抗炎的效果。

（A）p-p65、p65、p-IκBα、IκBα的表达；（B）NF-κB p65的核转位；（C）p-p38、p38、p-JNK和JNK的表达

图4皱皮木瓜纯化多酚提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞损伤的影响

Conclusion

富含绿原酸、原花青素B1和儿茶素（通过HPLC-Q-TOF-MS/MS测定）的皱皮木瓜纯化多酚提取物清楚地证明了体外抗炎特性。在LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中，纯化多酚提取物抑制NO产生和TNF-α、IL-6和IL-1β水平，并降低iNOS和COX-2的mRNA和蛋白质表达。皱皮木瓜纯化多酚提取物的抗炎作用的潜在机制是通过抑制IκBα和p65蛋白磷酸化，阻止NF-κB二聚体核转运，起到抗炎作用；也可以通过抑制p38和JNK蛋白的磷酸化，进而抑制MAPK信号通路中炎症信号传导，达到抗炎效果。因此，皱皮木瓜是抗炎剂的天然来源，可以开发成治疗炎症和疾病的产品。

一

胡付侠，女，工学硕士，山东农业大学食品科学与工程学院果蔬加工团队研究生，山东农业大学优秀研究生。读研期间在国内外公开发表学术论文3篇。

王兆升，男，博士，山东农业大学教授，硕士生导师，山东省重点扶持区域引进急需紧缺人才，山东省重大科技创新工程项目首席科学家，山东省林业科技创新团队特色果品贮藏加工岗位专家，山东省办理危害食品安全刑事案件食品安全专家，中国食品学会非热加工分会理事，中国农学会农产品贮藏加工分会理事，山东省食品学会理事。

主持或参与国家科技支撑计划、国家自然基金、山东省重大科技创新工程项目、山东省重点人才工程项目、省岗位专家项目及省重点研发计划项目10余项。申请国家发明专利6项，研发产品10余个，发表SCI、EI等高水平论文50余篇，主编、副主编全国统编本科教材4部，获山东省科技进步二等奖1项，市（厅）级科技进步二等奖1项，三等奖2项。

Phenolic compounds from Chaenomeles speciosa alleviate inflammation in lipopolysaccharide-treated RAW264.7 macrophages via the NF-κB and MAPK pathways

Fuxia Hua,1, Chao Liub,1, Fengqin Wanga, Changxin Zhoua, Maotong Zhua, Dongxiao Sun-Waterhousec,*, Zhaosheng Wanga,*

a Key Laboratory of Food Processing Technology and Quality Control in Shandong Province, College of Food Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China

b Key Laboratory of Novel Food Resources Processing, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Key Laboratory of Agro-Products Processing Technology of Shandong Province, Institute of Agro-Food Science and Technology, Jinan 250100, China

c School of Chemical Sciences, The University of Auckland, Private Bag 92019, New Zealand

1 Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

Chaenomeles speciosa (Sweet) Nakai cultivated widely in temperate regions possesses anti-inflammatory properties, however, the underlying molecular mechanisms remain not fully understood. In this study, a purified phenolic extract of C. speciosa rich in chlorogenic acid, procyanidin B1 and catechin (determined by HPLC-Q-TOF-MS/MS) exhibited dose-dependent anti-inflammatory effects on lipopolysaccharide (LPS)-treated RAW264.7 macrophages. The extract at 30 μg/mL was most potent and enabled most cells in normal morphology under LPS stimulation without causing cytotoxicity. The extract suppressed the levels of nitric oxide (NO), tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) and interleukin-1β (IL-1β), and the mRNA and protein expressions of nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2). The mechanisms underlying such anti-inflammatory actions included the regulation of phosphorylation of related proteins to monitor the expressions of inflammatory mediators and genes in the nuclear factor kappa-B (NF-κB) and mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathways. Therefore, the phenolic extract from C. speciosa is a desirable anti-inflammatory agent for inflammatory conditions to meet the rising demand for natural and cost-effective therapeutics.

Reference:

HU F X, LIU C, WANG F Q, et al. Phenolic compounds from Chaenomeles speciosa alleviate inflammation in lipopolysaccharide-treated RAW264.7 macrophages via the NF-κB and MAPK pathways[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(4): 1071-1080. DOI:10.1016/j.fshw.2022.10.025.

文章编译内容由作者提供

编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅

为构建多元化食物供给体系并兼顾生态环境保护，并形成以生物多样性保护促进食品生产的可持续性，北京食品科学研究院和中国食品杂志社将与北方民族大学、皖西学院、宿州学院、滁州学院于 2023年5月13-14日在中国宁夏银川 共同举办“ 生态保护与食品可持续发展国际研讨会 ”。本届研讨会将围绕新资源食品挖掘、动植物、微生物可替代蛋白、食用菌等食物资源的开发现状、重要创新进展及存在的问题开展研讨，探讨未来食品发展方向，通过展示我国生态保护与食品可持续发展等领域的最新科研成果，搭建科研单位与企业产学研结合的平台，共同促进我国食品产业发展快速踏入新里程。

Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。

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