J. Future Foods | UPLC-MS/MS法测定食品中L-ergothioneine

Introduction

L-ergothioneine（L-EGT，2-mercaptohistidine trimethyl betaine）是一种罕见的天然氨基酸，由Charles和Tanret于1909年从麦角真菌中发现。L-EGT由于具有很强的抗氧化活性，被认为是一种天然抗氧化剂。此外，作为自由基清除剂和金属离子螯合剂，L-EGT引起了广泛关注，并广泛应用于化妆品、食品、医药和生物医学。L-EGT主要存在于一些真菌和细菌中，但不存在于动物中，它由前体半胱氨酸、蛋氨酸和组氨酸合成。许多类型的蘑菇，包括紫牛肝菌、平菇、双孢蘑菇和玉米蘑菇，都发现了相对较高的L-EGT含量（0.15~7.27 mg/g 干质量）。2004年，L-EGT被中国国家药品监督管理局列为化妆品原料。同时，L-EGT是一种抗衰老成分，被添加到一些著名的化妆品中，如雅诗兰黛、迪奥和倩碧。研究表明，L-EGT具有显著的降低细胞氧化损伤的作用，具有较强的抗氧化和抗炎财产，为治疗癌症、糖尿病和心血管疾病提供了新的思路。

此外，由于具有抑制脂质和肌红蛋白氧化的功能，L-EGT在食品应用中充当天然抗氧化剂。Bao等人已经证明，L-EGT可以延缓脂质氧化和变色，并对牛肉和金枪鱼肉的颜色稳定性有积极影响。作为公认的安全（GRAS）产品，L-EGT营养补充剂已逐渐出现在市场上，如ERGOTHIONEINE、ErgoActive、ERGO+等。

作为一种新产品，安全评估是其广泛应用的必要条件。2016年10月26日，欧洲食品安全局（EFSA）饮食产品、营养和过敏小组根据第258/97号要求，通过了关于合成L-EGT作为新型食品安全性的科学意见。意见表明，当按照申请人的规定使用L-EGT时，即添加到各种食品组（即无酒精饮料、牛奶、乳制品、谷物棒和巧克力）中，并用作食品补充剂时，L-EGT是安全的。此外，L-EGT的预期用途和使用水平（表1）在2017年的进一步声明中通过科学研究规定。

表1 L-EGT作为食品成分的拟议用途和最大使用量

自从L-EGT被发现以来，除了其功能和应用外，科学家们还关注其有效的提取和检测方法。目前常用的测定L-EGT的方法主要有：分光光度法、薄层色谱法、毛细管电泳法（CE）、高效液相色谱法（HPLC）、高效气相色谱-串联质谱法（HPLC-MS）等。其中，分光光度法分析具有显著的缺点，即生物样品中的某些化合物（例如，L-半胱氨酸、谷胱甘肽、嘌呤、酪氨酸和组氨酸）可能发生测定反应或抑制反应的发展。在大多数研究中，HPLC已用于定量L-EGT，然而，HPLC的灵敏度低，容易受到基质干扰，因此无法检测低浓度的L-EGT。LC-MS具有高灵敏度和特异性的优点，已广泛应用于食品检测，但目前对LC-MS测定食品中L-EGT的研究很少。总的来说，L-EGT的测定已经越来越准确，基于超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）的L-EGT测定方法具有很大的技术优势。

目前，L-EGT可作为一种新型食品、抗氧化剂和防腐剂。因此，建立一种定量L-EGT的方法已成为一个紧迫的技术问题。本研究建立了基于UPLC-MS/MS的食品中L-EGT的测定方法。该方法可实现准确的定性和定量，为食品中L-EGT的测定提供参考。

Results and discussion

参数优化

本研究使用有机水溶剂作为萃取溶剂。参考先前的研究，选择了5 种不同的溶液（乙腈-水（70:30，V/V）、含0.1%FA的甲醇-水（70:30，V/V）、甲醇-水水（50:50，V/V）、甲醇水（70:30，V/V）和甲醇水（90:10，V/V））来评估对L-EGT提取效率的影响。结果表明，选择甲醇-水（70:30，V/V）作为预处理程序，能够获得最佳提取量。比较了超声、振荡和涡流等提取方法，发现L-EGT的提取能力没有显著差异。由于其稳定性和可接近性，选择超声15 min提取作为预处理工艺。

在本实验中，选择了三个色谱柱（Waters BEH C18、Waters BEH-Amido和Waters CORTECS HILIC）来研究L-EGT的分离和保留时间。结果表明，HILIC技术可以提高L-EGT的保留率和选择性，在优化色谱条件后，回收率和精密度达到令人满意的水平。此外，实验进一步优化了流动相，比较了甲醇、乙醇和乙腈的不同组成和浓度的分离效果。就最大分辨率和短保留时间而言，最佳选择是向去离子水和乙腈中加入0.1%FA。柱温度设定为40°C，为最佳温度。

质谱参数优化如表2所示，总结了用于鉴定和定量的最终MS/MS条件以及前体离子和产物离子。

表2 L-EGT的MRM参数

分析方法验证

根据欧盟委员会第657/2002[32]号决定，新开发的方法在选择性、线性、灵敏度、回收率、稳定性和精密度方面得到了验证。为了评估该方法对不同食品基质的适用性，对5 种不同的食品基质（无酒精饮料、牛奶、乳制品、谷物棒和巧克力）进行了方法验证。通过比较空白样品和加标样品的色谱图，对基质干扰进行了实验评估。当洗脱L-EGT时，所有测试基质均未发现干扰峰。添加标准物质的产品色谱图如图1所示。

图1 从提取的离子色谱（XIC）分析中得到色谱峰。（A） 乳制品，（B）无酒精饮料，（C）谷物棒，（D）巧克力，（E）牛奶。

根据不同的基质，如上所述制备了一系列标准溶液。在所有基质中，L-EGT响应在对应于5−200 ng/mL的浓度范围内呈良好的线性关系（表3），相关系数（R2）均大于0.999。如表3所示，L-EGT的LOD和LOQ分别为10和20 µg/kg（牛奶、无酒精饮料、乳制品）和20和40 µg/kg（谷物棒、巧克力）。

表3 L-EGT的校准曲线、LOD和LOQ

如表4所示。在3 个浓度水平下，5 种样品的平均回收率在83.7%~107.5%之间，符合委员会第2002/657/EC号决定中的真实性要求。该方法的平均重复性（RSD（%））为0.88%~6.84%，表明其也符合委员会第2002/657/EC号决定的标准。通过在48小时内重复测量5 次L-EGT浓度来评估批间精密度。对于每个样品系列，在0、6、12、24和48小时采集阳性样品，并分别确定为RSD（%）。日间精密度确定在5%以内，表明UPLC-MS/MS分析为定量测定L-EGT提供了令人满意的稳定性（表5）。

表4 L-EGT的回收率和RSD（n=6）

表5 食品中L-EGT的稳定性测定

真实产品中L-EGT的测定

如表6所示，发现4 个样品含有零可检测浓度的L-EGT，在谷物棒中检测到（63.1±2.3）μg/kg（平均值±SD）L-EGT。此外，通过报告的方法对牛奶样品进行了重复分析，未检测到类似的L-EGT。该分析方法为食品样品中L-EGT的鉴定和定量提供了一种简便有效的方法。

表6 实际样品中检测到的L-EGT浓度

Conclusion

本研究开发了一种新的UPLC/EESI-MS/MS方法，用于灵敏和准确地测定食品样品中的L-EGT。选择70%甲醇-水作为预处理工艺，并使用HILIC分离L-EGT。该方法的准确度（83.7%~107.5%）、精密度（RSD，0.88%~6.84%（n = 6） ）和较低的LOQ（20~40 μg/kg）。在最佳方案中，作者验证了不同的食品，其性能符合分析方法所需的标准。该方法成本低，样品预处理和测量方便，适用于L-EGT样品的分析。此外，它为极性化合物的分离、分析和检测提供了另一种方法，这些极性化合物在RP色谱上的保留较差。

Determination of L-ergothioneine in food by UPLC-MS/MS method

Hongwen Zhai, Lei Sun, Sufang Fan, Jing Wang, Meirong Cao, Hongyu Ma, Qiang Li, Yan Zhang*

Hebei Food Safety Key Laboratory, Key Laboratory of Special Food Supervision Technology for State Market Regulation, Hebei Engineering Research Center for Special Food Safety and Health, Hebei Food Inspection and Research Institute, Shijiazhuang 050227, China

*Corresponding authors.

Abstract

L-Ergothioneine (L-EGT) possesses excellent antioxidant activity and has been used in the food, pharmaceuticals and cosmetics industries. In this study, a new efficient and sensitive ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was established for the quantitative determination of L-EGT in food. The sample was extracted with methanol-water (70:30, V/V), separated by hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) and detected by triple-quadrupole mass spectrometry. Validation studies were carried out on different product and the limit of quantitation was 20 μg/kg (milk, alcohol-free beverages, dairy products) and 40 µg/kg (cereal bars, chocolate). Excellent linearity (correlation coefficient (R2) ≥ 0.999) was achieved for L-EGT quantification in the range of 5–200 ng/mL. The recoveries of the method (83.7%−107.5%) and the relative standard deviation (RSD, 0.88%−6.84% (n = 6)) meet the performance criteria required for the determination of L-EGT in food. Finally, the applicability of the method was tested by analysing actual samples. In general, the method developed is simple, reliable, accurate, and stable and could be useful for routine analyses of L-EGT in food.

Reference:

ZHAI H W, SUN L, FAN S F, et al. Determination of L-ergothioneine in food by UPLC-MS/MS method[J]. Journal of Future Foods, 2023, 3(2): 163-168. DOI:10.1016/j.jfutfo.2022.12.007.

编辑：王佳红；责任编辑：张睿梅

封面图片来源：图虫创意

Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。

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