FSHW | 超声波预处理结合糖基化和磷酸化对α-乳白蛋白致敏性的影响

Introduction

α-乳白蛋白（Bovine α-lactalbumin，BLA）是牛乳中第二大乳清蛋白，也是人乳中主要的乳白蛋白。BLA是分子量为14.2 kDa的钙结合单体球状蛋白，含有123个氨基酸残基和四个二硫键，能与金属离子紧密结合，并因其营养特性而被广泛应用于婴儿配方奶粉。但BLA具有致敏性，在IgE介导的牛奶过敏反应中，有30%～35%是由BLA引起的，导致BLA的使用受到限制。因此，亟待研发高效脱敏技术以期降低其致敏性。

非热加工结合蛋白质修饰技术因其能降低蛋白质的致敏性，且具有其他方法无法比拟的优点而备受关注，如超声辅助糖基化修饰、动态高压微流化辅助糖基化修饰、脉冲电场辅助糖基化修饰等技术可显著降低过敏蛋白的致敏性。我们前期的研究证实了超声波处理结合糖基化修饰可以通过破坏BLA抗原表位来消减其致敏性，但超声预处理结合糖基化和磷酸化修饰是否也能达同样的效果尚不清楚。

江西师范大学生命科学学院陈文美硕士、刘俊副教授和和涂宗财教授 以BLA为研究对象，探究超声波预处理结合糖基化和磷酸化对BLA特异性抗体的结合能力、组胺和白细胞介素-6释放率的影响；采用光谱、高分辨质谱等技术对BLA的多级结构、修饰肽段和位点进行表征。本研究为制备低致敏性蛋白或奶粉提供一种有效的脱敏技术。

图1 超声波预处理结合糖基化和磷酸化对BLA致敏性的影响

Results and Discussion

特异性抗体的结合能力

使用间接竞争ELISA法评估超声波处理结合糖基化和磷酸化对BLA致敏性的影响，结果如图2所示。BLA经磷酸化修饰后IgE（图2A）和IgG（图2B）结合能力降低；当BLA被糖基化和磷酸化修饰后，特异性抗体的结合能力显著降低，而经超声波预处理结合糖基化和磷酸化修饰的BLA具有最低的结合能力。这说明超声预处理改变BLA的结构，加速其与半乳糖和磷酸基团发生反应，有效降低BLA的致敏性。

图2采用间接竞争ELISA法检测IgE (A)和IgG (B)结合能力

组胺和白细胞介素6水平

介质释放与Ⅰ型过敏反应的发生密切相关，采用细胞实验评估RBL-2H3细胞释放的介质来确定DH-BLA、SP-BLA、U-SP-BLA、Gal-SP-BLA和U-Gal-SP-BLA的致敏性。如图3所示，DH-BLA、SP-BLA、U-SP-BLA、Gal-SP-BLA和U-Gal-SP-BLA显著影响RBL-2H3细胞释放组胺和白细胞介素-6的能力（P＜0.05）。通过比较磷酸化、超声结合磷酸化、糖基化结合磷酸化修饰的BLA发现，超声波处理结合糖基化和磷酸化修饰的BLA具有最低的介质释放率（P＜0.05）。组胺（图3A）和IL-6（图3B）的释放率顺序为DH-BLA＞SP-BLA＞U-SP-BLA＞Gal-SP-BLA＞U-Gal-SP-BLA，这一结果可能是由于SP-BLA、U-SP-BLA、Gal-SP-BLA和U-Gal-SP-BLA对RBL-2H3的作用，这种作用可以改变蛋白质表面的IgE表位并阻碍嗜碱性粒细胞的脱颗粒。

图3 RBL-2H3细胞释放组胺（A）和白细胞介素-6（B）水平

内源荧光强度和表面疏水性

当290 nm处激发时，DH-BLA、SP-BLA、U-SP-BLA、Gal-SP-BLA和U-Gal-SP-BLA的荧光强度逐渐降低（图4A），这可能是由屏蔽效应和溶剂效应引起的。磷酸化可以降低BLA的荧光强度，且超声预处理能促进其降低，与DH-BLA、SP-BLA、U-SP-BLA和Gal-SP-BLA的荧光强度相比，U-Gal-SP-BLA的荧光强度最低。最大发射波长显示Gal-SP-BLA和U-Gal-SP-BLA的荧光强度略有增加，表明糖基化和磷酸化诱导了BLA结构的变化，导致Trp残基暴露于微环境中。

如图4B所示，天然BLA和DH-BLA的表面疏水性没有显著变化（P>0.05），而DH-BLA、SP-BLA、U-SP-BLA、Gal-SP-BLA和U-Gal-SP-BLA的表面疏水性逐渐降低，结果表明磷酸化和糖基化诱导BLA一些疏水基团的掩蔽，降低其表面疏水性。超声波结合磷酸化、糖基化结合磷酸化、超声波结合糖基化和磷酸化处理的BLA呈类似的结果。

图4 N-BLA、DH-BLA、SP-BLA、U-SP-BLA、Gal-SP-BLA和U-Gal-SP-BLA的内源荧光强度（A）和表面疏水性（B）

修饰位点

图5为采用高效液相色谱-质谱鉴定修饰肽段和位点质谱图。如图5A所示，在U-Gal-SP-BLA中，未被修饰的肽段1-25的m/z为725.8277 4+ ，当其被磷酸化和糖基化修饰后，m/z分别为765.3387 4+ 和805.1248 4+ 。该结果表明序号为1～25的肽段被一分子Gal和两分子磷酸基团修饰。而肽段92-102的m/z为409.5990 3+ （图5B），经糖基化修饰后，其m/z为571.6157 3+ ，表明该肽段具有三个糖基化位点。

通过HPLC-HCD/ETD-MS/MS鉴定糖基化和磷酸化位点的位置。在U-Gal-SP-BLA中（图5C），m/z为805.1248 4+ 的肽段 1 EQLTKCEVFRELKDLKGYGGVSLPE 25 的MS/MS图谱中含有一系列的b和y离子。通过这些片段离子进行匹配发现，磷酸化位点为T4和S22，K13被糖基化修饰。肽段 92 VKKILDKVGIN 102 的糖基化位点为K93、K94和K98（图5D）。在U-SP-BLA中，磷酸化位点有T4、Y18、S22、T29、T30、T33、S34、T38、S69、S76和Y103。Gal-SP-BLA的糖基化位点K13、K16、K58、K62、K93、K94、K98、K108、K114和磷酸化位点T4、S22、T29、T30、T33、S34、S69。在U-Gal-SP-BLA中，R10、K13、K16、N44、K58、K62、K79、K93、K94、K98、N102、K108和K114被Gal糖基化修饰，T4、Y18、S22、T33、S34、Y36、T38、Y103和S112被磷酸化修饰。这些结果表明，超声预处理促进了糖基化和磷酸化位点的增加。

从图6的带状图中也可发现，超声波处理结合糖基化和磷酸化处理的BLA后，其糖基化位点（R10、N44、K79、K108、N102和K114）和磷酸化位点（Y36和S112）均分布在BLA分子中。由此可见，超声波处理使BLA的空间构象发生改变，增加其糖基化和磷酸化修饰位点。

图5 高效液相色谱-质谱鉴定修饰肽段和位点

图6 U-SP-BLA、Gal-SP-BLA和U-Gal-SP-BLA（PDB491 1F6S）的带状图。修饰位点着色如下：浅青色，BLA结构；红色，磷酸化位点；绿色，糖基化位点

Conclusion

超声波预处理结合糖基化和磷酸化显著降低了BLA的IgE/IgG结合能力、RBL-2H3细胞中组胺和白细胞介素-6释放率，且改变了其内源荧光强度和表面疏水性，增加了糖基化位点（R10、N44、K79、K108、N102和K114）和磷酸化位点（Y36和S112）。糖基化和磷酸化位点的增加，促使超声波预处理结合糖基化和磷酸化修饰的BLA具有最低的致敏性。因此，BLA的致敏性降低，主要是由于糖基化位点结合磷酸化位点的屏蔽效应和构象结构的变化。

第一作者

陈文美，女，现为江西师范大学生命科学学院硕士研究生，主要研究方向为食品营养组分相互作用。以第一作者在国内外期刊发表论文6篇，其中SCI收录5篇，授权国家实用新型专利1件。

通信作者

涂宗财，男，1965年2月出生，江西靖安人。中共党员、工学博士、二级教授，南昌大学食品科学与工程、食品营养与卫生专业博士生导师，江西师范大学化学生物学专业博士生导师。2010年至今，担任江西师范大学副校长，党委委员。现为国家大学科技园和国家自然科学基金等评审专家、江西省科协副主席、中国农业工程学会农产品加工与贮藏分会副理事长、江西省食品科学与技术学会副理事长等。

主要研究领域为水产品加工及高值化利用、极端条件下食品营养成分改性及相互作用和食物资源中有效成分提取与利用等，在JAFC、FCH等国内外权威杂志上发表学术论文300多篇，其中SCI/EI收150多篇，出版学术著作9部，获得国家发明专利授权40件；主持国家“蓝色粮仓”重点研发专项课题、国家自然科学基金、国家“863”课题、“973”课题等国家级项目25项和省部级项目35项。获江西省自然科学一等奖、国家教育部高等学校科学研究优秀成果奖、江西省科技进步奖等省部级奖12项，江西省优秀新产品奖1项。入选“新世纪百千万人才工程”国家级人选，享受国务院特殊津贴，是“全国优秀科技工作者”、国家现代农业技术体系岗位科学家，是江西省主要学科学术与技术带头人，高校中青年学科带头人，首批入选省“赣鄱英才555工程”，南昌大学食品科学与技术国家重点实验室学科带头人。

Structure and allergenicity of α-lactalbumin: effects of ultrasonic prior to glycation and subsequent phosphorylation

Wenmei Chena,1, Qiongzhen Chena,1, Houze Zhoua, Yanhong Shaoa, Yang Wanga, Jun Liua,*, Zongcai Tua,b,*

a National R & D Center for Freshwater Fish Processing, College of Life Science, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China

b State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China

1 Wenmei Chen and Qiongzhen Chen are co-first authors of the article.

*Corresponding author.

Abstract

Bovine α-lactalbumin (BLA) induced severe cow's milk allergy. In this study, a novel strategy combining ultrasonication, performed before glycation, and phosphorylation was proposed to reduce BLA allergenicity. Result showed that IgE- and IgG-binding capacities and the release rates of histamine and interleukin-6 from RBL-2H3 were reduced. Moreover, intrinsic fluorescence intensity and surface hydrophobicity were decreased, whereas glycated sites (R10, N44, K79, K108, N102 and K114) and phosphorylated sites (Y36 and S112) of BLA were increased. Minimum allergenicity was detected during BLA treatment after ultrasonic prior to glycation and subsequent phosphorylation because of considerable increase in glycated and phosphorylated sites. Therefore, the decrease in allergenicity of BLA, the effect correlated well with the shielding effect of glycated sites combined with phosphorylated sites and the conformational changes. This study provides important theoretical foundations for improving and using the ultrasonic technology combined with protein modification in allergenic protein processing.

Reference:

CHEN W M, CHEN Q Z, ZHOU H Z, et al. Structure and allergenicity of α-lactalbumin: effects of ultrasonic prior to glycation and subsequent phosphorylation[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(3): 825-831. DOI:10.1016/j.fshw.2022.09.021.

文章编译内容由作者提供

编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅

封面图片来源：图虫创意

Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。

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