中山大学周建华团队《Small》：可长时滞留膀胱内的三层结构空气微泡用于增强膀胱灌注治疗作用

膀胱灌注治疗指将治疗药物经尿道滴注进膀胱内，使药物直接作用于膀胱的病灶部位以实现治疗效果。膀胱灌注治疗被广泛应用于膀胱疾病的治疗，如膀胱癌和膀胱炎。膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，约70%的膀胱癌病例病理分型为非肌层浸润性膀胱癌。目前，临床上治疗此类病理分型膀胱癌的方式为手术切除，然后在术后进行膀胱灌注治疗。然而，注入膀胱的药物会因排尿而排出膀胱，导致药物浓度迅速降低，作用时间短，无法有效降低膀胱癌进展和复发风险。

为了克服当前膀胱灌注治疗技术领域存在的药物于膀胱内作用时间短的问题，近年来研究人员开发了基于漂浮材料的膀胱灌注治疗给药系统，以延长膀胱灌注治疗中药物有效浓度时间，但存在局限性。如漂浮材料在尿液中的稳定性差，无法长时间滞留于膀胱内且容易造成尿路阻塞，影响膀胱正常的生理功能。因此，开发可实现膀胱内长时给药的膀胱灌注治疗药物输送体系十分必要，达到既可在排尿后留在膀胱中又不干扰膀胱正常生理功能的目的。

近日，中山大学生物医学工程学院周建华教授团队提出一种牛血清白蛋白-空气微泡（BSA-MBs）。BSA-MBs为特定的三层结构，即外膜、中间药物装载层和内部空气芯，其具有低密度、易于漂浮且十分稳定的特点，可以长时间漂浮并粘附在膀胱壁上，不随排尿而排出体外，显示出在膀胱中长时滞留的特性。此外，BSA-MBs的中间药物装载层具有高药物装载能力，负载阿霉素（DOX）的BSA-MBs（DOX-MBs）可用于膀胱灌注治疗，改善膀胱癌预后。注射到膀胱的DOX-MBs可以漂浮滞留长时间并控制释放DOX，显示出强大的抗癌功效。因此，BSA-MBs在膀胱中的长时滞留使其成为膀胱灌注治疗的有效漂浮药物输送系统。该工作以题为“Long-Term Retention Microbubbles with Three-Layer Structure for Floating Intravesical Instillation Delivery”的文章发表于Small上，文章的第一作者是中山大学博士邓秋榕，周建华教授为本文的独立通讯作者。该研究得到国家重点研发计划（2017YFE0102400）、国家自然科学基金（No.22004135和No.32000939）、深圳市科技计划（No.JCYJ201908073000608、JCYJ20190755805818和GXWD20201231165807008、20200824162253002）和中央高校基本科研基金（No.20lgzd28和20lgpy124）的支持。

BSA-MBs制备与表征

图1 通过表面交联-冷冻干燥方法制备BSA-MBs及其在膀胱灌注治疗中的应用

通过表面交联-冷冻干燥方法制备BSA-MBs有三个步骤：1）W/O液滴由微流控芯片装置制备得到，并在含有交联剂的溶液中进行表面交联形成具有核-壳结构的稳定BSA微囊（BSA-MCs）；2） BSA-MCs在低温环境中冷冻成固体；3） 将冷冻干燥的BSA-MCs重新悬浮到水溶液中形成BSA-MBs。光学图像显示，BSA-MBs具有特定的三层结构，即外膜、中间药物装载层和内部空气芯。制得的BSA-MBs可以漂浮在水溶液表面，并且在排尿期间长时间稳定地滞留于膀胱内。此外，得益于中间层，BSA-MBs可以装载大量药物。这些优异的性能使BSA-MBs成为膀胱灌注治疗药物递送应用的理想载体。

BSA20-MBs在膀胱中的稳定性和滞留

图2 BSA20-MBs在膀胱中长时间稳定滞留

稳定性是空气微泡用于膀胱灌注治疗的关键，因此研究了BSA 20-MBs在溶液中的稳定性。结果显示，在人工尿液中连续培养5天后BSA 20- MBs的内部空气芯大小变化可以忽略不计，且80%的BSA 20-MBs仍然稳定地漂浮在水面上。BSA20-MBs在人工尿液中具有高稳定性，原因为中间药物装载层防止空气从微泡的内芯扩散和溶解，同时，BSA20-MBs具有疏水外壳，在冷冻干燥后变得致密有助于防止空气逃逸。

此外，BSA 20-MBs可以长时间漂浮在溶液表面上，滞留能力在膀胱假模型中得到证实。BSA 20-MBs由于浮力漂浮在人造尿液表面，在排尿过程中，由于“毛细效应”BSA20-MBs聚集并粘附在膀胱壁上，随着尿液在膀胱中再次生成，BSA20-MBs重新漂浮在液体表面。BSA20-MBs具有超稳定性和长期滞留膀胱能力。

BSA20-MBs体外生物安全性及DOX-MBs体外抗癌效果

图3 DOX-MBs控制释放DOX和体外抗癌效果

BSA 20-MBs在所有测试浓度下显示出很小的细胞毒性，当测试浓度高达5 mg/mL时，HaCaT细胞的存活率仍达到90%，BSA20-MBs具有良好的生物相容性。共焦激光扫描显微镜显示MB49癌细胞可有效吸收DOX-MBs控制释放的DOX。将MB49细胞与DOX-MBs（10 µg/mL）共孵育24小时、48小时和72小时后，用Calcein AM（活细胞绿色荧光染料）进行染色，结果显示DOX-MBs组中MB49细胞的绿色荧光没有明显增强，表明DOX-MBs可以抑制MB49细胞增殖。

DOX-MBs小鼠体内抗癌效果及安全性

图4 DOX-MBs对小鼠MB49原位膀胱肿瘤的抗癌效果

将成功种植MB49原位膀胱肿瘤的小鼠随机分为三组：（1）对照组、（2）游离DOX组和（3）DOX-MBs组。每周给小鼠进行膀胱灌注治疗，共治疗4次。在为期28天的膀胱灌注治疗后，游离DOX组的肿瘤略小于对照组，而DOX-MBs组肿瘤生长被显著抑制，表明DOX-MBs具有优越的治疗性能。DOX-MBs对原位膀胱肿瘤表现出优异的抗癌效果，这归因于其在膀胱中的长时间稳定滞留和控释DOX。此外，结果显示DOX-MBs组所有小鼠均存活且体重没有显著降低，主要器官切片中未发现组织学异常，DOX-MBs的毒性低，可以用作一种有效安全的膀胱灌注治疗药物递送系统。

【小结】

该工作开发了一种表面交联-冷冻干燥方法制备BSA-MBs，具有良好的三层结构，即外膜、中间药物装载层和内部空气芯。该微泡可以稳定地漂浮在水溶液表面，长时间滞留于膀胱中。此外，中间药物装载层显示出高载药量和药物控释的优异性能，具有抗肿瘤效果。BSA-MBs成为第一个同时满足膀胱灌注治疗所需要求的空气微泡药物输送载体，该项工作对于其他生物医学应用（如胃药物递送系统）的开发也具有重大的参考意义。

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来源：高分子科学前沿

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