《食品科学》：南昌大学吴志华教授等：巴西坚果过敏原Ber e 1的分离纯化及表征鉴定

坚果是一类外壳坚硬，内部包含可食用果仁的食物，也是8大类过敏食物之一。巴西坚果（Bertholletia excelsa）又名巴西栗，也称鲍鱼果，营养丰富，是玉蕊科巴西栗属的植物，主要生长在亚马逊地区如巴西、秘鲁、哥伦比亚和委内瑞拉等。巴西坚果过敏的症状包括喉咙瘙痒、唇肿、呼吸困难、黄斑疹等。国际免疫学会联合会已经确认了其中的2 种过敏原蛋白，Ber e 1和Ber e 2。

南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室的唐 宇、徐骥远、吴志华等人将巴西坚果粉碎脱脂提取粗蛋白后，采用阴离子层析法纯化巴西坚果过敏原蛋白Ber e 1，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）联用和免疫印迹实验（Western blot）对其进行鉴定，通过圆二色谱和紫外分光光度计表征其二、三级结构。

1、巴西坚果粗提蛋白SDS-PAGE分析

结果表明3 个平行中，第1次提取的粗蛋白质量浓度为（43.4±1.7）mg/mL，第2次提取的粗蛋白质量浓度为（11.2±1.2）mg/mL，而第3次提取的粗蛋白质量浓度仅为（1.9±0.1）mg/mL。说明巴西坚果脱脂粉经两次浸提后，剩余可溶蛋白已经很少。由图1可知，3 个平行间及每个平行的3 次提取间，获得的蛋白没有明显的组分差别；但随着提取次数的增多，粗提蛋白质量浓度显著下降，目的蛋白Ber e 1的含量也有所降低。由于第3次提取液中蛋白质量浓度不到第1次提取液的5%，所以只取前两次提取液混合进行Ber e 1的分离纯化，灰度扫描显示，混合液中目的蛋白Ber e 1含量约占总蛋白的30%，与文献报道的巴西坚果中过敏原蛋白Ber e 1的含量一致 。

2、离子交换层析分离纯化巴西坚果过敏原Ber e 1分析

如图2所示，峰1（即穿过峰）中含大量高纯度的过敏原蛋白Ber e 1，Ber e 1的等电点为pH 6.3，在所选平衡缓冲液的pH值下带负电荷，可以被阴离子交换树脂吸附，但可能由于目的蛋白Ber e 1和阴离子交换树脂的结合能力较弱，可直接被不含NaCl的磷酸盐缓冲液洗脱下来，也有部分蛋白结合在柱上，在梯度洗脱过程中被高盐溶液洗脱下来。峰1处收集到的蛋白经SDS-PAGE及灰度扫描，显示Ber e 1纯度大于95%。

3、巴西坚果过敏原Ber e 1的LC-MS/MS鉴定分析

由表1可知，共检测到4 条Ber e 1的特征肽段，除信号肽外检测出的肽段覆盖率为36.5%，质谱结果认定该蛋白为巴西坚果过敏原Ber e 1。

4、巴西坚果过敏原Ber e 1的血清识别分析

如图3所示，粗蛋白泳道和纯化的目标蛋白泳道均有显色，且Ber e 1对2 位过敏患者的血清都有较强的反应，进一步说明本实验分离得到了巴西坚果过敏原，且蛋白Ber e 1免疫活性保持良好。此外，在粗蛋白泳道的29 kDa处（即Ber e 2）和30～100 kDa之间的蛋白条带也有显色，其中第1位坚果过敏患者的血清（图3b）对30～100 kDa之间的多个蛋白条带识别更强，显色更深。这说明除已知两种过敏原蛋白Ber e 1、Ber e 2外，巴西坚果中可能还存在其他种类的未知过敏原蛋白。

5、巴西坚果过敏原Ber e 1二级结构的表征

从图4可以看出，过敏原蛋白Ber e 1在193 nm波长处有最大吸收峰，在208 nm（ α -螺旋肽键的π-π * 跃迁）和222 nm（ α -螺旋肽键的n-π*跃迁）波长处有2 个负的特征肩峰谱带，表明Ber e 1中明显存在 α -螺旋结构。通过圆二色谱在线软件分析，结果显示巴西坚果过敏原蛋白Ber e 1中 α -螺旋含量占30.6%，在文献报道的 α -螺旋占比范围内， β -折叠含量占19.0%， β -转角含量占22.9%，无规卷曲含量占27.6%。

6、巴西坚果过敏原Ber e 1三级结构的初步表征

由图5可知，在250～280 nm波长附近有较大吸收。由于芳香氨酸残基的侧链的谱峰常因微区特征的不同而改变，芳香族氨基酸残基的侧链之间及其与二硫键的谱峰均可能会产生重叠 。已有研究表明Ber e 1的两个亚基是通过4 个二硫键连接起来的 ，这可能对250～280 nm波长之间的吸收峰有影响，所以在275 nm及282 nm波长处没有明显的酪氨酸特征吸收峰，这在一定程度上说明了所纯化的过敏原蛋白Ber e 1的二硫键未被破坏，其高级结构未展开。此外，因Ber e 1的蛋白序列中不含色氨酸 ，所以在290～310 nm之间没有色氨酸的特征峰。当前鲜见表征过敏原蛋白Ber e 1三级结构的报道，因此本研究为过敏原蛋白Ber e 1的后续研究奠定了一定的基础。

7、巴西坚果过敏原Ber e 1的得率分析

如表2所示，在一次典型的纯化过程中，上样体积为6 mL，总蛋白质量浓度为26.0 mg/mL，获得纯化的Ber e 1约22.4 mg，计算可知，Ber e 1得率为47.8%，则1 g巴西坚果脱脂粉可以得到约74.6 mg目的蛋白Ber e 1。

结 论

以巴西坚果仁为原料，通过粉碎、脱脂、浸提获得粗蛋白，采用阴离子交换层析法分离纯化Ber e 1蛋白，通过LC-MS/MS对纯化的蛋白进行鉴定。一步分离纯化即可得到纯度95%以上的巴西坚果过敏原蛋白Ber e 1，纯化过程中，蛋白得率为47.8%，一次纯化量可超过20 mg。经Western blot、圆二光谱仪及紫外分光光度计测定分析表明，纯化的蛋白保持自身高级结构，能够被巴西坚果过敏患者的血清准确识别。当前我国对巴西坚果过敏原的研究较少，本研究纯化Ber e 1的技术路线简单，对设备要求低，耗时短且制备量大，可以为巴西坚果过敏原Ber e 1相关研究和应用奠定一定基础。

本文《巴西坚果过敏原Ber e 1的分离纯化及表征鉴定》来源于《食品科学》2022年43卷18期286-291页，作者：唐 宇，徐骥远，张 英，罗水忠，吴志华。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210930-362。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

图片来源于文章原文及摄图网。

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