浙大中科大齐发 Nature！分子互作技术到底牛在哪？

今年八月份的 Nature 期刊中，来自中国科学技术大学与浙江大学的科学家们，以「背靠背」的方式发表了两篇文章，阐明了植物生长素运输蛋白 PIN 的结构和工作机制。

1880 年，达尔文父子提出了「向光性」生长的猜想。1928 年，温特首次提出了「生长素」的概念。而吲哚-3-乙酸（IAA）作为植物中主要的生长素，几乎参与了植物生长发育调控的每一个过程。生长素在细胞与细胞之间会发生极性运输，而膜上的转运蛋白在极性运输过程中发挥了关键作用，其中生长素外排蛋白家族 PIN 尤为重要。这两篇研究论文，解析了单独 PIN、PIN-生长素 IAA 复合物和PIN-除草剂 NPA 复合物三个高分辨率结构，并利用Biacore 分子互作技术阐明了膜蛋白 PIN 与生长素小分子 IAA 和除草剂 NPA 的识别和转运机制[1,2]。

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会上您可以了解到：

1. 技术大牛是如何使用 Biacore 助力抗体评价、药物发现的；

2. Biacore 最前沿的科研进展；

3. 新一代系统新增的特色功能，为什么更适合分子量很小的植物激素、不稳定的膜蛋白以及多元复合体的研究。

言归正传，让我们回到开篇提到的两篇精彩 Nature 文献，对其中的 Biacore 分子互作技术进行解读，了解一下这个不可或缺的技术究竟有多强大。

除草剂 NPA 抑制 PIN3 转运生长素 IAA 的分子机制

首先，体外放射性 IAA 转运试验证明了 PIN3 可以运输 IAA，并且在加入除草剂 NPA 后有效抑制了 IAA 的流出。进一步的结构解析显示 PIN3、PIN3-IAA 和 PIN3-NPA 的结构十分类似，并且，IAA 或 NPA 与 PIN 的结合方式类似。之后，科研人员通过 Biacore 实验测出 PIN3 与 IAA 体外亲和力为 160.4 μM，PIN3 与 NPA 的亲和力为 56.2 μM，强于 IAA 与 PIN3 的亲和力（图 1）；对 PIN3 蛋白上关键氨基酸进行单点突变后发现与 IAA 的亲和力显著降低，同时发现这些突变体与 NPA 的亲和力也显著降低（图 2）（表 1），这些结果表明，这些氨基酸位点在 IAA 和 PIN3 的结合上起关键作用， 且 NPA 和 PIN3 的结合位点与 IAA 和 PIN3 的相同。

图 1：Biacore 实验检测，野生型 PIN3（WT）与生长素 IAA 及其与除草剂 NPA 的亲和力[1]

图 2：Biacore 实验检测，各突变型 PIN3 与生长素 IAA 及其与除草剂 NPA 的亲和力[1]

表1 Biacore 实验检测，各突变型与野生型 PIN3 与生长素 IAA 及其与除草剂 NPA 的亲和力[1]

因此，NPA 通过直接结合在 PIN3 蛋白上的 IAA 结合位点，以较高的亲和力抑制 PIN3 的 IAA 转运活性，阐明了 PIN3 与生长素 IAA 和除草剂 NPA 的识别和转运机制。

PIN1 与 IAA 的互作检测

正所谓「一蛋双黄，好事成双」 。中国科学技术大学研究团队同样地解析了 PIN 蛋白家族另一个成员 PIN1、PIN1-IAA 和 PIN1-NPA 的结构。他们通过 Biacore 实验发现 PIN1 能与生长素 IAA 直接结合，亲和力 KD 为 186 μM（图 3），与 PIN3 与 IAA 的亲和力（KD 为 160.4 μM，图 1）相当；同时，他们还检测了 PIN1 与其他天然生长素（IBA、IPA、4-Cl-IAA）均能结合（图 3）。

图 3：Biacore 实验检测， PIN1 与四种天然生长素 IAA、IBA、IPA、4-Cl-IAA 的亲和力[2]

这两个研究为剖析植物生长素运输调控以及针对 PIN 蛋白的农业用除草剂和植物生长调节剂的设计开发奠定了重要基础。值得注意的是，两篇文章中均检测了膜蛋白 PIN 与小分子 IAA 的亲和力，该检测中存在两大难点：

1. 小分子 IAA 的低分子量（175 Da）意味着结合产生的信号不会太高，对检测设备的灵敏度提出了更高的要求。

Biacore 以其卓越的灵敏度，对于小分子的检测无分子量下限，具有高达pg级别的超高灵敏度 0.03 RU（RMS），能够确保低信号的结合也能精确检测；

2. PIN 作为膜蛋白，结构灵活度大、表达量低且较难纯化，纯化后的蛋白也极易失活。因此，检测技术需要既能保证 PIN 蛋白活性状态，又能对其开展理化性质表征。

Biacore 分子互作系统即是采用了一种持续流检测技术，时刻保证 PIN 蛋白处于溶液状态，并且无需对分子进行标记处理，减少对蛋白空间构象的影响，为膜蛋白的检测保驾护航。

同一期的两篇 Nature 文章，出自国内两个顶级科研单位。但他们却不约而同地选择使用 Biacore 技术，看似巧合，实则必然。

Biacore 作为分子互作检测的「金标准」，以其卓越的性能，为不同领域的科学研究提供了大量精准的数据，已经助力超过五万篇文献的发表，更是在去年 FDA 获批上市的 9 款抗体新药中，就有 8 款均采用了 Biacore 技术完成了研发和申报，成为了发表高分文章和药物研发的重要工具。

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2022.11.24 敬请期待，不见不散！

内容审核：邹礼平
项目审核：周育红

题图来源：图虫创意

参考文献：

[1] Su, Nannan et al. “Structures and mechanisms of the Arabidopsis auxin transporter PIN3.” Nature vol. 609,7927 (2022): 616-621.

[2] Yang, Zhisen et al. “Structural insights into auxin recognition and efflux by Arabidopsis PIN1.” Nature vol. 609,7927 (2022): 611-615.