《食品科学》：南昌大学熊涛教授等：乳酸乳球菌乳亚种NCU036018细菌素的分离纯化及其抗菌机制

近年来，越来越多滥用抗生素的行为导致了病原菌耐药性（AMR）的出现，进而提高了病原菌给食品和医药行业所带来的健康风险。而在食品行业中常用的防腐剂主要为化学合成防腐剂，对人体健康存在一定的安全隐患。因此，绿色天然的细菌素是最具潜力的化学防腐剂的安全替代品之一。细菌素是细菌核糖体产生的一类具有抑菌活性的蛋白类或多肽类物质。它可以通过特异型靶点和非特异性靶点破坏细胞膜的完整性和通透性，或进入细胞内影响DNA和蛋白质的正常代谢等抑制或杀死病原菌，但经人体摄入后可被胃肠道蛋白酶消化酶解，不会破坏肠道菌群的微生态平衡。

乳酸链球菌素是联合国粮农组织/世界卫生组织食品法典委员会在1969年唯一认定为安全的菌素，可作为食品添加剂。但乳酸链球菌素只能在一定的pH值范围内（pH 3.5～8.0）发挥作用，并且随着pH值和温度的升高，其活性也会下降。因此，相对于乳酸链球菌素，市场上更需要活力强且使用范围广的新型细菌素有效遏制致病菌的滋生，以推动食品防腐剂市场的发展。南昌大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室的许晓燕、彭 珍*、熊 涛*等旨在对筛选自传统发酵泡菜中的乳酸乳球菌乳亚种所产细菌素进行分离鉴定，并探究其对金黄色葡萄球菌的抑菌机制，为食品级细菌素在食品行业和制药领域中的应用提供理论支撑。

1、产细菌素乳酸菌鉴定

从发酵泡菜中筛选到的乳酸菌分离株D1对金黄色葡萄球菌具有显著抑菌活性，如图1所示，该菌株在MRS固体平板上菌落形态较小，白色圆润光滑，圆形凸起，边缘整齐有光泽；在油镜下呈卵圆状，成对排列，革兰氏染色呈阳性。

生理生化结果显示，菌株D1过氧化氢酶阴性，能发酵葡萄糖、半乳糖、麦芽糖和甘露醇，不能利用菊糖，不能在45 ℃条件下生长，不耐4%的NaCl。

16S rDNA鉴定结果显示（图2），菌株D1与乳酸乳球菌乳亚种相似度达100%，结合生理生化实验确定菌株D1为乳酸乳球菌乳亚种，并将其命名为乳酸乳球菌乳亚种NCU036018。

2、乳酸乳球菌NCU036018发酵上清液抑菌分析

pH值对发酵上清液抑菌活性的影响

由表1可知，随着pH值的升高，乳酸乳球菌乳亚种NCU036018发酵上清液的抑菌活性呈现出显著下降趋势（P＜0.05），但在pH 10时仍保留了70%以上的活性，说明该抑菌成分具有较好的pH值稳定性。

酶处理对发酵上清液抑菌活性的影响

如表1所示，乳酸乳球菌乳亚种NCU036018发酵上清液经淀粉酶和脂肪酶处理后，抑菌活性无显著变化（P＜0.05），经过氧化氢酶及胃蛋白酶处理后抑菌活性略有下降，经胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K和α-糜蛋白酶处理后抑菌活性完全丧失。由此可以初步确定乳酸乳球菌乳亚种NCU036018发酵上清液主要抑菌成分可能是蛋白类物质。

温度发酵上清液抑菌活性的影响

乳酸乳球菌乳亚种NCU036018发酵上清液经121 ℃高温高压处理后其抑菌活性略有下降，但仍保留了90%以上（P＜0.05），50～100 ℃等不同温度处理后抑菌活性无显著变化。说明乳酸乳球菌乳亚种NCU036018发酵上清液中抑菌物质的热稳定性良好，可能为耐热的乳酸乳球菌素。

3、乳酸乳球菌乳亚种NCU036018生长及抑菌活性曲线

如图3所示，乳酸乳球菌乳亚种NCU036018在MRS液体培养基中培养4 h左右进入对数期，8 h左右进入稳定期。发酵液pH值先快速下降随后逐渐稳定在4.2左右。发酵上清液抑菌活性随培养时间呈先上升后下降的趋势，在14 h处达到峰值，抑菌圈直径为13.60 mm，此时为细菌素的最佳收获时间，这与已有研究结果相似。细菌素一般为次级代谢产物，通常是发酵中后期代谢产物，但也有文献报道某些细菌素为初级代谢产物。此外，发酵后期（18～36 h）上清液的抑菌活性显著降低，这可能与菌体释放的一些水解酶有关。

4、细菌素分离纯化

硫酸铵沉淀

如表2所示，随着硫酸铵饱和度的上升，乳酸乳球菌乳亚种NCU036018发酵上清液沉淀物的抑菌活性先上升后下降。在饱和度为70%时，其对金黄色葡萄球菌的抑菌活性达到最强，抑菌圈直径为13.96 mm。因此，后续选择70%的硫酸铵进行盐析。

超滤

硫酸铵沉淀蛋白复溶物经超滤后得到4 个组分，其对金黄色葡萄球菌的抑菌活性见表3，其中截留分子质量为10～30 kDa的组分抑菌圈最大，具有最强的抑菌活性，推测纯化的目的细菌素蛋白分子质量在10～30 kDa范围内。

SP Sepharose Fast Flow纯化

大多数细菌素表现出一种阳离子结构，富含带正电的精氨酸和赖氨酸残基，有利于这些多肽和微生物细胞膜之间的相互作用。因此，可通过阳离子交换层析对细菌素进行纯化。如图4所示，0.2 mol/L NaCl洗脱组分具有较高的抑菌活性，说明该组分中含有目的抑菌蛋白。

Tricine-SDS-PAGE

将0.2 mol/L NaCl溶液洗脱下来的组分除盐后经Tricine SDS-PAGE分析，观察到泳道上出现较为单一的蛋白条带，分子质量在14.4～20 kDa范围内，见图5。

5、乳球菌素036018抑菌机制分析

乳球菌素036018对金黄色葡萄球菌的MIC

如表4所示，当乳球菌素036018稀释倍数为128 倍时，出现了肉眼可见的最小抑菌圈，直径为（7.78±0.12）mm。因此，乳球菌素036018对金黄色葡萄球菌的MIC为0.50 mg/mL。

乳球菌素036018对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响

生物膜是微生物在器皿和非器皿表面形成的有结构的微生物聚集体，是食品的一个重要潜在污染源。一些致病菌在食品表面进行定植形成一层生物膜屏障外界的不利环境从而发挥致病作用。如图6所示，与对照组相比，经乳球菌素036018处理后，金黄色葡萄球菌生物膜的形成率降至25.51%，说明乳球菌素036018对金黄色葡萄球菌生物膜的形成有较强的抑制作用，可以降低其致病能力。

K＋泄露

如图7所示，随着乳球菌素036018处理时间的延长，金黄色葡萄球菌细胞外K ＋ 质量浓度呈上升趋势，且远高于对照组水平。因此，乳球菌素036018可能破坏了金黄色葡萄球菌细胞膜的完整性导致K ＋ 向胞外释放。其他的细菌素也具有相同的报道，如抗菌肽AMP-jsa9、植物乳杆菌素GZ1-27、抗菌肽F1均通过破坏细胞膜通透性导致K ＋ 泄漏。对照组在0～120 min内胞外钾离子水平相对稳定在较低水平，而在120～180 min内有较大幅度的上升，可能是因为培养时间过长，菌体在无营养条件下自身死亡从而释放出胞内K ＋ 所导致。

PI染色

由图8可知，红色的金黄色葡萄球菌的数量随着乳球菌素036018处理时间的延长而明显增加，而对照组则无明显变化。结果说明乳球菌素036018处理之后金黄色葡萄球菌的细胞膜造成损伤，通透性增加，并且具有时间依赖性。

扫描电子显微镜观察

如图9所示，对照组的细胞结构完整饱满，表现出典型的球状、光滑的细胞膜特征。乳球菌素036018处理不同时间后，金黄色葡萄球菌细胞形态发生明显变化：0.5 h后细胞表面出现轻微皱缩和凹陷；处理时间延长至1 h时，细胞表面有明显的孔洞和大范围的皱缩；处理时间为2 h时，细胞开始表面出现裂纹甚至破碎，有的细胞开始发生溶解。这些结果表明，乳球菌素036018能以时间依赖性方式破坏金黄色葡萄球菌细胞膜结构甚至使其溶解。

6、乳球菌素036018在牛奶中防腐能力评价

如图10所示，接种金黄色葡萄球菌的牛奶于4 ℃贮存12 h后，对照组菌落数略有升高，但不同浓度乳球菌素036018均在2 h内表现出显著的抑制作用（P＜0.05），且存在剂量依赖，随后菌落数均趋于稳定。其中，8MIC乳球菌素036018的处理有效降低了3 个数量级的金黄色葡萄球菌。这些数据表明，乳球菌素036018是一种有潜力的生物防腐剂，可以在运输和保藏过程中控制乳制品中的金黄色葡萄球菌数量。

结 论

从传统发酵泡菜中分离出1 株产细菌素的乳酸乳球菌乳亚种NCU036018，其发酵上清液对金黄色葡萄球菌具有显著的抑制作用，且对pH值、温度稳定，对胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、α-糜蛋白酶敏感，推测其抑菌成分为细菌素。通过硫酸铵沉淀、超滤、阳离子交换层析纯化出细菌素乳球菌素036018，其分子质量为14.4～20 kDa，MIC为0.50 mg/mL。乳球菌素036018能有效抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成，可通过破坏细胞膜完整性、改变膜通透性抑制金黄色葡萄球菌。此外，乳球菌素036018在牛奶基质中能有效抑制金黄色葡萄球菌的生长。综上，细菌素乳球菌素036018具备作为生物防腐剂在食品中应用的潜力。

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通信作者简介

熊涛，男， 1970年生，营养与食品卫生学博士，南昌大学食品学院二级教授，博士生导师。现为南昌大学食品科学与技术国家重点实验室常务副主任，食品学科特区食品发酵工程方向负责人。入选国家百千万人才工程、 “赣鄱英才555工程”领军人才工程、“赣江海智”领军人才、云南省“高层次柔性引进人才”、江西省主要学科学术和技术带头人、江西省新世纪百千万人才工程、江西省高等学校中青年学科带头人、江西省青年科学家（井冈之星），授予“国家有突出贡献中青年专家”、“十三五”轻工行业科技创新先进个人荣誉称号、享受国务院特殊津贴专家、荣获“庆祝中华人民共和国成立70周年纪念章”。兼任中国饮料工业协会果蔬汁分会副会长，中国饮料工业协会常务理事，中国饮料工业协会第四届技术工作委员会委员，中国农学会食物与营养专业委员会常务委员、中国食品学院联盟专家委员会委员、中国微生物学会科技开发与咨询工作委员会委员，中国食品科学技术学会益生菌分会理事，中国食品科学技术学会传统酿造食品分会理事，江西食用菌产业协会副会长，江西食品科学技术学会常务理事，美国食品科技协会（IFT）会员，中文核心期刊《饮料工业》《中国酿造》杂志编委。荣获国家科技进步二等奖、国家级教学成果奖二等奖，江西省技术发明一等奖、江西省科学技术进步一等奖，中国侨界贡献奖（创新成果）、中国产学研创新合作成果一等奖、中国食品科学技术学会科技创新奖一等奖、宝钢优秀教师奖各一项。主要研究方向为益生菌及大宗果蔬高值化利用。

彭珍，女，1986年生，南昌大学食品学院讲师，慕尼黑工业大学食品微生物专业博士，从事乳酸菌抗菌肽的资源开发与利用，成果可广泛运用于乳肉及果蔬制品防腐。近年来，主持横向课题1项、申请和授权国家发明专利4项、以第一或通讯作者发表SCI和中文核心论文十余篇；主持省级教改课题1项、指导互联网＋大赛全国大赛（中央组织部）获得银奖、获得江西省教学成果奖一等奖、参编国家重点图书和高等学校专业教材各1部；受邀参加中国-加拿大、中国-德国、中国-日本国际会议3次。

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第一作者简介

许晓燕，女，1996年生，硕士就读于南昌大学食品学院生物工程专业，研究方向为食品生物技术，以第一作者发表EI论文一篇。

本文《乳酸乳球菌乳亚种NCU036018细菌素的分离纯化及其抗菌机制》来源于《食品科学》2022年43卷16期209-216页，作者：许晓燕，彭珍，熊世进，肖沐岩，黄涛，熊涛。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210902-018。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

图片来源于文章原文及摄图网。

为进一步促进动物源食品科学的发展，带动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和提高生活品质，北京食品科学研究院和中国食品杂志社在宁波和西宁成功召开前两届“动物源食品科学与人类健康国际研讨会”的基础上，将与郑州轻工业大学、河南农业大学、河南工业大学、河南科技学院、许昌学院于 2022年12月3-4日 在河南郑州共同举办“2022年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”。欢迎相关专家、学者、企业家参加此次国际研讨会。