基础科研要勇于尝试和创新：沈阳药科大学团队鉴定中药成分靶点以PROTAC技术.发表于中科院1区

沈阳药科大学陈丽霞和李华团队创造性地将Protac技术引入到了中药研究领域，在Acta Pharmaceutica Sinica B（APSB）发表了题为“PROTAC Technology as a Novel Tool to Identify the Target of Lathyrane Diterpenoids”的研究论文 doi: 10.1016/j.apsb.2022.07.007。

活性中药成分及天然产物因其独特的生物相容性、新颖的结构和广泛的药理活性，是先导化合物和新药发现的源泉，其作用靶点的鉴定是理解作用机理和指导后续结构优化的关键。然而通常来说，中药成分及天然产物的药效是通过与多个靶点的相互作用来实现的，它们与靶蛋白的亲和力并不很强，这种作用机制的复杂性为其靶点鉴定带来很大挑战。对于中药成分及天然产物的靶点鉴定，目前主要有三种方法：基于亲和力的靶点鉴定、基于活性的蛋白质谱分析（ABPP）和无标签的靶点鉴定。ABPP专门用于识别功能活性蛋白质，如酶。传统的基于亲和力的下拉方法取决于小分子化合物和靶点蛋白质的瞬时结合，这种结合需要足够强，以便从整个蛋白质组中分离目标蛋白质；此外，下拉分析的准确性受实验设计和操作方面的显著影响。现有的无标签靶点识别方法，如DART或CETSA联合质谱法等，也受到靶标－小分子结合亲和力和靶标蛋白对蛋白水解或热变性敏感性的限制。

PROTAC技术中的蛋白降解剂是一种含有两个活性端的小分子化合物，一个活性端可与靶蛋白结合而另一个活性端结合E3连接酶；两个活性端通过linker相连接。鉴于PROTAC分子往往无需很强的亲和力即可有效地特异性降解靶蛋白，沈阳药科大学的研究团队大胆猜想该技术可用于鉴定中药成分及天然产物的作用靶点。研究人员将PROTAC技术与定量蛋白组学、微量热泳动（MST）分子互作检测技术相结合，从被降解的差异蛋白中找到中药靶点，并通过下游的一系列分子、生物化学和动物实验得到了功能验证。该流程被研究团队称为“靶向降解组学”，可以为中药成分的靶点鉴定提供新的解决方案。

实验解读

沈阳药科大学陈丽霞和李华团队在前期研究中从中药千金子中获得了一系列千金烷二萜类化合物，其中ZCY-001化合物具有最强的抗炎活性，并且具有低毒性。

研究人员将该化合物的核心骨架Lathyrol（即千金子二萜醇）与沙利度胺 (E3连接酶CRBN配体) 通过PEG linker相连，得到了PROTAC分子ZCY-PROTAC。使用该PROTAC分子对细胞进行处理后提取蛋白，并使用TMT串联质谱标签进行标记定量蛋白组学分析（图1 A）。比较蛋白组学分析发现MAFF蛋白在ZCY-PROTAC处理后发生了最为显著的降解。Western Blot结果也显示, MAFF蛋白的降解水平与ZCY-PROTAC的剂量和作用时间是正相关的（图1 B）。

这些结果表明，该蛋白可能是Lathyrol等千金烷二萜类化合物的最主要靶点。

图1 ZCY-PROTAC可显著降解MAFF蛋白

为了验证比较蛋白组学发现的靶点蛋白，研究人员采用微量热泳动(MST）技术直接检测Lathyrol及其衍生物ZCY020与MAFF蛋白的结合能力。

如下图所示，Lathyrol与MAFF的亲和力为20.90 μM，ZCY020对MAFF的亲和力也在同一水平。以上亲和力检测结果也通过表面等离子共振（SPR）、细胞热迁移分析（CETSA）以及DARTS等实验得到了验证。这些结果证实了MAFF蛋白是中药千金子成分的直接作用靶点。

图2 微量热泳动技术（MST）检测中药千金子活性成分与MAFF蛋白相互作用

研究人员进一步采用生化和药理学实验深入研究阐明了千金烷二萜ZCY020以MAFF为靶点蛋白, Nrf2/HO-1信号通路为作用途径发挥抗炎作用。ZCY02可以促进MAFF-Nrf2异源二聚体的形成而抑制MAFF同源二聚体，进而调节HO-1的下游表达，从而在体内外发挥抗氧化和抗炎活性。

本研究创造性地将PROTAC技术应用在了中药成分靶点的鉴定上，首先以中药活性成分为基础合成出PROTAC分子探针，再通过蛋白的特异性降解来发现中药活性成分的靶点蛋白。以MST为代表的的分子互作检测技术在靶点验证中发挥了重要作用，可直接定量分析中药活性成分与靶点蛋白的亲和力。作者将这一系列技术手段整合为一套可行的中药成分靶点鉴定新方法，可以有力地补充甚至替代现有技术。

与基于亲和力的靶点鉴定不同，基于PROTAC方法的靶点鉴定并不总是需要靶点蛋白与化合物之间的强结合，而是依赖于靶点-PROTAC-E3连接酶三元复合物的形成。此外，这种三元复合物甚至可以稳定微弱的配体-靶蛋白相互作用，导致靶点的有效降解，并提高配体的选择性。只要观察到靶点蛋白的降解，该方法就是有效的。此外，对于中药成分或天然产物，它们往往作用于多个靶点，并且与靶点蛋白的结合亲和力偏弱或适中，基于亲和力的靶点鉴定方法更容易得到假阳性或假阴性结果。因此，基于Protac方法的靶点鉴定将是目前可用方法的一个很好替代和补充。此外，基于Protac的靶点鉴定，其读出的是比较定量蛋白质组学的最终降解结果，在某种程度上是一个放大的信号；而且，由于省略了基于亲和探针方法所需的下拉分析，可以消除由于实验设计和操作导致的误差。

部分内容来源于公众号NanoTemper

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