德国科学家揭示士的宁合成途径，为碱衍生物异源生产提供遗传基础

士的宁又名番木鳖碱，属单萜吲哚生物碱类，是中药马钱子的主要有效成分，也是有毒成分。士的宁具有镇痛、抗炎和抗肿瘤作用，系中枢递质甘氨酸的拮抗剂，对脊髓有高度的选择性兴奋作用，是一种十分常用的临床用药，常用于治疗轻瘫或弱视。

1818 年，法国化学家和药剂师 Pierre Joseph Pelletier 等从植物马钱子（这种植物在中药中已经被应用了上千年。）中分离出士的宁，作为人类得到的第一个纯生物碱，其分离成功具有划时代意义。1838 年，Regnault 通过化学降解方法给出其正确的分子组成。且由于其 7 环复杂结构极大的挑战了经典化学降解法，因而，从 19 世纪 80 年代就开始的化学降解工作直到 1946 年才由 Robinson 完成，Robinson 指出，就其分子大小而言，它是已知的最复杂的物质。

士的宁分子包含了 7 个环和 6 个手性中心，是结构最为复杂的天然产物之一，对合成化学具有极大的挑战。合成士的宁不仅可以解决来源问题，也可为结构修饰和构效关系研究打下良好基础。化学家们准备开发新的合成转化策略以获得这种分子支架，因此有必要了解其天然生物合成途径。

▲图 | 士的宁化学结构（来源：维基百科）

1948 年，Woodward R B 就提出了士的宁的部分生物合成假说，并通过对马钱子喂养放射性同位素标记的底物得到了证实；该研究表明士的宁来自色氨酸和焦磷酸香叶酯，它们可生成士的宁的重要中间产物：geissoschizine 和魏兰-盖里希醛（Wieland–Gumlich aldehyde）。然而，其中间步骤仍不清楚。此外，士的宁可通过羟基化和甲基化生成马钱子碱，该合成过程也不清楚。

近日，Nature 上发表了一篇名为“Biosynthesis of strychnine”的文章，德国马克斯-普朗克化学生态学研究所的研究人员 Benke Hong 博士和 Sarah O'Connor 博士利用代谢物分析、转录组分析和本氏烟草中的酶学表征，解析了植物中参与士的宁和马钱子碱生物合成的一系列步骤及其相关的酶基因，揭示了士的宁生物合成的完整途径。

（来源：Nature）

依据三个标准确定可生产士的宁的候选基因

在前期研究中，已经明确的是，在植物体内，士的宁及其下游产物马钱子碱的合成都来自于一种名为 GPP 的非共轭二烯和色氨酸，通过植物体内某些酶的作用下，二者经过一系列转化转变为 geissoschizine ，随后， geissoschizine 经过一些列酶的氧化还原作用转变为魏兰-盖里希醛 Wieland–Gumlich aldehyde，经过这一关键中间体进一步转变为士的宁及马钱子碱。

此次，为了解析士的宁生物合成的完整途径，该研究首先比较了马钱子属中可生成士的宁的 S. Nux-vomica 和不可生成士的宁的 Strychnos sp 的代谢产物；结果显示，S. Nux-vomica 的根可积累士的宁、异士的宁（isostrychnine）、β-可鲁勃林（β-colubrine）和马钱子碱，而 Strychnos sp 中并不存在。

接着，该研究对两种植物进行了组织特异性 RNA 测序，以发现相关基因。由于 geissoschizine 的生物合成途径已在系统发育相关植物长春花中完全阐明，通过基因对比和鉴定，可以证明 geissoschizine 的生物合成途径在长春花及可以产生士的宁的 S. Nux-vomica 中是保守的。而这些基因都优先在马铃薯根中表达，表明士的宁生物合成主要发生在根中。

▲图丨士的宁及马钱子碱合成的关键中间体（来源：研究论文）

依据上述信息，科研人员根据 3 个标准确定了一系列的可生产士的宁的候选基因：1）在 S.nux-vomica 的根中高表达；2）与假定的上游基因共表达；3）可编码具有催化功能的蛋白质，这些催化功能与假设的生物合成途径的化学逻辑一致。

▲图丨士的宁产生株和马钱子碱产生株候选基因表达分析（来源：研究论文）

通过基因表达探索确定生物合成士的宁途径

其次，针对 geissoschizine 如何转化为魏兰-盖里希醛 Wieland–Gumlich aldehyde 的问题，考虑到魏兰-盖里希醛 Wieland–Gumlich aldehyde 和已知的早期生物碱中间体 dehydropreakuammicine 结构具有相似性。

研究人员推测，魏兰-盖里希醛 Wieland–Gumlich aldehyde 可通过 dehydropreakuammicine 的酯水解、脱羧、氧化和还原来生成。如果这一化学逻辑是正确的，那么 S.nux-vomica 应该包含一个同系物地瓜碱氧化酶（CrGO）。而它也已经从长春花中分离出来了。

按此推测，该研究发现了参与这些反应的相关基因，并分别命名 SnvGO、SnvNS1/SnvNS2、SnvNO 和 SnvWS（Figure 1a）。这些基因的不同组合与 geissoschizine 共浸润表达均可导致魏兰-盖里希醛 Wieland–Gumlich aldehyde 的形成。

▲图1丨达波灵、士的宁和马钱子碱的完整生物合成途径（来源：研究论文）

尽管 Strychnos sp 不能生成士的宁，但它可以产生类似化合物，达波灵（diaboline）。该研究发现， Strychnos sp 具有上述基因的同源物，也可生成魏兰-盖里希醛 Wieland–Gumlich aldehyde 。不同的是，魏兰-盖里希醛 Wieland–Gumlich aldehyde 在 Strychnos sp中由 BAHD 酰基转移酶 SpAT 转变为达波灵；而 S. nux-vomica 中的 BAHD 酰基转移酶 SnvAT 则介导了 N-丙二酰魏兰-盖里希醛的生成。值得注意的是，N-丙二酰魏兰-盖里希醛可直接在生理条件下缓慢转变成士的宁和异士的宁，无需酶的催化；另外，高温可以加速该转变过程（Figure 1b）。

马钱子碱是士的宁的衍生物，同样可在 S. nux-vomica 的根部积累。通过类似的方法，该研究解析了从士的宁生成马钱子碱的各个步骤及其相关的酶；并分别命名为：Snv10H、SnvOMT 和 Snv11H，其中 SnvOMT 可同时介导 β-可鲁勃林和马钱子碱的生物合成（Figure 1a）。

▲图丨完整的生物学合成路径（来源：研究论文）

总的来说，研究人员报告了与士的宁生物合成有关的九种酶的发现。但并未找到相应的酶来催化士的宁生物合成的最后一步，相反，他们意识到这种转化是自发发生的，不需要酶。当前的研究为使用代谢工程方法生产天然植物产品开辟了新的可能性。