细菌内毒素的检测方法

一、鲎变形细胞溶解物(limulus amocbocyte lysate,LAL)试验

内毒素的检测常用家兔热原法和LAL试验（简称为“鲎试验”)法。家兔热原法是检测内毒素的第一种标准方法，鲎试验法则是目前最常用的内毒素检测方法。我国药典收载的细菌内毒素检测方法为鲎试验法，包括2种方法，即凝胶法和光度测定法，后者又包括浊度法和显色基质法。当各种检测法得到的检测结果不一致时，以凝胶法的检测结果为准。

检测过程中应防止内毒素污染。鲎试验法检测须使用鲎试剂。鲎试剂是从海洋节肢动物鲎的血液中提取其变形细胞溶解物、再经低温冷冻干燥制成的一种生物试剂，其因能与内毒素和(1,3)-β-D-葡聚糖反应形成凝胶而被广泛用于检测食品、水源、药品、医疗器械以及动物和人体体液等不同样本中的内毒素。鲎的血液和淋巴液中有一种有核的变形细胞，这种细胞胞浆内有大量的致密颗粒，内含凝固酶、C-因子、B-因子和凝固蛋白原等。内毒素与鲎试剂接触后可激活C-因子，激活的C-因子又可激活B-因子或由(1,3)-β-D-葡聚糖激活G-因子，激活的B-或G-因子可再激活凝固酶原，使之转变为凝固酶，继而使可溶性的凝固蛋白原转变成凝固蛋白，由此使鲎试剂变为凝胶状态[1,2-3]。凝固酶对鲎三肽有酰氨酶活性，可使硝基苯胺游离而发生生色反应。

鲎试验法有定性和定量之分，其按试验方法还可进一步分为凝胶法、动态浊度法、终点浊度法、动态显色法和终点显色法。

凝胶法系应用鲎试剂可与内毒素发生凝集反应的原理来定性或半定量检测内毒素的一种鲎试验法，检测时鲎试剂须以除热原水（内毒素检查用水）复溶后使用，通过观察有无凝胶形成作为检测终点。凝胶法检测操作简便、经济，不需使用专用检测设备。

动态浊度法、终点浊度法、动态显色法和终点显色法都是内毒素的定量检测方法。动态浊度法和终点浊度法都属浊度法。浊度法是通过检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化来检测内毒素含量的鲎试验法，其中动态浊度法检测反应混合物浊度升高至某一预先设定的吸光度时所需的时间或浊度升高的速率。

动态显色法和终点显色法都属显色基质法。显色基质法是通过检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物游离出生色团的多少来检测内毒素含量的鲎试验法，根据产物色度计算内毒素水平，又被称为比色法。

动态浊度法和动态显色法检测都须有带温育系统的动态光度测定仪器及其配套软件。动态浊度法和动态显色法检测操作简便、线性范围宽。终点显色法检测须有配套的酶标仪或可见分光光度仪。

就定量检测而言，比较同一个体内毒素水平的变化较比较不同个体或不同方法检测到的内毒素水平的差异更有意义。内毒素可被捕获在血凝块中，因此选用血浆样本检测内毒素较选用血清样本检测更好〔检测时建议使用低浓度肝素)。检测时应防止环境内毒素的污染。

定性鲎试验法主要用于药品、医疗器械等样本的内毒素监测。定量鲎试验法主要用于临床患者的内毒素检测，为其临床诊治提供参考。一项研究显示，对血液透析患者的内毒素检测，动态浊度法的检测结果较显色基质法更为准确[4]。

(1,3)-β-D-葡聚糖是真菌细胞壁的主要组分，鲎试剂中含有对其敏感的G-因子和会转变并形成凝胶的凝固蛋白原。使用鲎试剂检测(1,3)β-D-葡聚糖的试验被称为G-试验，临床上用于侵袭性真菌感染的早期诊断。

二、替代检测方法

鲎是珍稀动物，保护力度越来越大。因此，研发鲎试验的替代方法成为当务之急。替代方法主要有蛋白染色法、荧光偏振法、同位素标记法和酶联免疫测定法等。不过，这些替代方法的临床应用价值仍待进一步研究或确认，目前临床上应用最多的依然是鲎试验法。

参考文献

[1]Su W, Ding X. Methods of endotoxin detection [J].J Lab Autom,2015,20(4): 354-364.

[2]Munford RS.Endotoxemia-menace , marker, or mistake? [J].J Leukoc Biol, 2016,100(4):687-698.

[3]Gnauck A,Lentle RG, Kruger MC.Chasing a ghost?-Issues with the determination of circulating levels of endotoxin in human blood [J].Crit Rev Clin Lab Sci, 2016,53(3): 197-215.

[4]Wong J,Davies N, Jeraj H, et al. A comparative study of blood endotoxin detection in hacmodialysis patients [J/OL].J Inflamm(Lond),2016,13:24[2018-10-06].doi:10.1 186/s12950-016-0132-5.

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文章来源：上海医药 2018年 第39卷 第21期 （11月上），本文节选自：《细菌内毒素检测方法及其临床应用》，文章作者：沈银忠。如有侵权，请联系删除，谢谢！