FSHW-中科院2区-西北大学等基于HPLC-MS法同时鉴定并定量分析不同产地红枣提取物的化学成分及保肝活性

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Introduction

红枣属于鼠李属鼠李科，在中国被用作食物和传统药物已有数千年的历史。中国是世界上最大的红枣产地，产量占世界总产量的90%以上。枣树广泛分布在我国北方，特别是陕西、河北、山西、山东、河南和新疆等省。近年来，人们对红枣的化学和生物活性进行了大量的研究。研究表明，红枣中含有多种化学成分，如三萜酸、黄酮类化合物、生物碱、酚酸、多糖等。红枣具有多种生物活性，如保护肝、抗氧化、抗炎、抗肿瘤以及潜在的镇静作用。其中，红枣含有腺苷3',5'-环磷酸腺苷（cAMP）和鸟苷3',5'-环磷酸腺苷（cGMP）等核苷酸和碱基，红枣的应用价值十分广泛。因此，研究不同产地红枣中的化学成分及含量是很有必要的。

高效液相色谱法（HPLC）已应用于定性和定量分析，可作为鉴定和评价复杂性质中草药质量的一种方法。在定量方面，高效液相色谱和液相色谱质谱（LC-MS）联用分析已被证明是一种快速有效的分析技术。鲜有对红枣提取物进行定性和定量分析的色谱方法。而且，目前国内还没有关于不同地区样品的测定研究，也缺乏对众多不同地区样品进行区分的方法。

西北大学的Tianyi Wang、Tianyi Wang、Naisheng Bai*，美国罗格斯大学的Chi-Tang Ho*等 本研究旨在建立一种对红枣中活性物质进行定性和定量分析的有效方法。利用所建立的方法，进一步研究了我国不同地区红枣中主要化合物含量的差异。利用聚类分析（HCA）方法，对12个不同省份红枣品种的28个提取物的18个主要成分进行了分析。所获得的定量数据可用于红枣中生物活性成分的质量控制，对红枣中生物活性成分的研究具有重要意义。

Results and Discussion

红枣提取物的分离与鉴定

首先通过柱层析的方法，从红枣中提取并分析出18个主要成分。然后建立一种快速有效的HPLC方法，通过测定所研究分析物的线性度、LOD、LOQ、精密度、重复性、稳定性和准确性，以及精密度、重复性和保留时间的稳定性，验证了所提HPLC方法的有效性。结果表明所建方法对18个主要成分的检测具有有效性。接着通过比较各个主要成分的高效液相色谱保留时间、质谱、紫外光谱结合核磁氢谱与核磁碳谱数据，最终确定这18个主要成分如图1所示，依次为3-O-trans-p-coumaroyl alphitolic acid（1）、3-O-cis-p-coumaroyl alphitolic acid（2）、3β-O-trans-p-coumaroyl maslinic acid（3）、traumatic acid（4）、(E)-11-oxohexadec-9-enoic acid（5）、7(E)-9-keto-hexadec-7-enoic acid（6）、9(E)-11-oxo-octadecenoic acid （9CI）（7）、quercetin-3-O-rutinoside（8）、芹菜素（9）、cAMP（10）、苯甲酸（11）、1,2,4-苯三醇（12）、4-羟基苯甲酸（13）、水杨酸（14）、3,4-二羟基苯甲酸（15）、对羟基苯甲醛（16）、顺式对羟基肉桂酸（17）、反式对羟基肉桂酸（18）。

图1 红枣提取物中18个主要成分的化学结构式

不同产地红枣提取物的含量测定及聚类分析

含量分析

将所建立的高效液相色谱法应用于中国不同省份红枣提取物中18个化学成分的同时测定。首先建立18个化学成分的标准曲线，然后计算不同产地红枣提取物中各个化学成分的含量（图2）。

图2 标准品溶液（A）和样品溶液（B）的HPLC-DAD色谱图，峰号为图1中所示的化合物

结果显示，陕西佳县木枣的乙醇提取物中上述化合物的总含量高达888.41 µg/g，而新疆和和田玉枣的乙醇提取物含量仅为471.92 g/g。在实验中单个化合物中也观察到显著的含量差异。例如，化合物1和化合物2在许多样品中未能检测到，虽然在一些样品中发现了这种物质，但其含量非常少（最高为2.86µg/g）。而化合物13，在山东冬枣水提液中含量为263.81 µg/g，然而在新疆和田玉枣乙醇提液中含量仅为32.85 µg/g。化合物10，陕西佳县木枣醇提物中含量最高，为366.54 µg/g，新疆和田玉枣水提物中含量最低，为56.04 µg/g。此外，使用不同的提取方法，也存在一定差异性。化合物3和化合物6在乙醇提取物样品中均有检测到，但在水提取物样品中未能检测到。还发现红枣中酸类物质更多，如酚酸（化合物13–15、17、18）和脂肪酸（化合物4、5、7），与酸类含量相比，黄酮类化合物（化合物8、9）和二萜类化合物（化合物物1–3）含量并不丰富。

聚类分析

通过对含量结果的分析，进一步发现不同产地、不同提取方法所得到的红枣提取物无论是在各成分含量高低还是在化合物种类上均存在一定差异性。接着利用层状聚类分析方法进一步进行研究分析。

HCA的树状图如图3所示。从树状图的顶部到底部，所有的红枣样品明显地分为4个主要类群。第一个集群由B1、E1、F1、L1–N1（陕西，水提物）和D1、G1（山西，水提物），第二组由A、H、I、K（新疆，醇提物），第三个集群包含C、C1、J、J1（山东）、D、G（山西，醇提物）和A1、H1、I1、K1（新疆，水提物H2O-extracts），最后一组由B、E、F、L–N（陕西，醇提物）。结果表明，基于18种成分含量的HCA可作为鉴别中国不同地区红枣样品的有效方法。此外，这所有化合物在各组群中的含量差异也可以通过HCA热图清晰地显示出来。结果发现，醇提物和水提物在热图上的颜色排列完全不同，差异非常大，可以作为对不同红枣提取物样品进行分类的一种方法。最后，化合物7和化合物13群组的颜色变化显著。可能说明这两种化合物在不同产地的含量变化较大，可作为红枣样品分类和质量控制的潜在化学标志物。

红色表示浓度较高，蓝色表示浓度较低，白色表示微量浓度。

图3 28个枣树样品HCA的树状图和热图

红枣主要化学成分的保肝活性

最后，对18种化合物的保肝性能进行了研究。采用乳酸脱氢酶（LDH）释放试验评价肝细胞保护作用。采用强效肝毒性化合物CCl4诱导建立人肝癌细胞（HepG2）损伤模型。1%的CCl4对HepG2细胞具有明显的细胞毒性，如图4所示，LDH的释放量可达到60 mU/mL左右，而红枣中化合物1–12和16–18对LDH的释放量相较于模型组有轻微的降低作用，而化合物6和7则表现出更明显的降低效果。结果表明，红枣中大部分化合物均具有潜在的肝细胞保护作用。其中，化合物7具有显著降低LDH释放的能力，而化合物13对LDH的释放没有任何抑制活性。结合HCA结果，可以推断化合物7和13不仅是红枣的生物活性标记，也是红枣分类的植物化学标记。

图4 红枣提取物对肝细胞的保护作用

Conclusion

综上所示，本研究首次建立了一种简便、快速的基于液质联用技术的方法，对产自中国的12个不同地区的28份红枣样品中的18种植物化学成分进行了鉴定和含量分析。结果表明，该方法能有效地区分不同产地的红枣样品，不同品种和提取方法的红枣样品中活性物质含量存在差异，并且研究了化学成分潜在的保肝性能。总而言之，该方法可作为红枣产品质量控制和标准化的前提条件，且其主要成分对人体健康有益。

Simultaneous quantification of 18 bioactive constituents in Ziziphus jujuba fruits by HPLC coupled with a chemometric method

Tianyi Wanga,1, Sen Guoa,b,1, Xiameng Rena, Junfeng Duc, Lu Baib, Xueqin Cuib, Chi-Tang Hod,*, Naisheng Baia,*

a College of Food Science and Technology, Northwest University, Xi’an 710069, China

b College of Chemical Engineering, Northwest University, 229 Taibai North Road, Xi’an 710069, China

c Shaanxi Family Forestry Bureau, Shaanxi Jiaxian Development and Reform and Science and Technology Bureau, Yulin 719200, China

d Department of Food Science, Rutgers University, New Brunswick 08901, USA

1 The authors contributed equally to this article.

*Corresponding author.

E-mail address: ctho@sebs.rutgers.edu

nsbai@nwu.edu.cn

Abstract

The fruit of Ziziphus jujuba Mill., known as Hongzao (or Hong-Zao) in Chinese and cultivated in China for more than 4000 years, has shown to have hepatoprotective property. In previous study, we have isolated and identified 27 known compounds from Z. jujuba fruits, which demonstrated anti-tumor activity. In this study, a high-performance liquid chromatography-diode-array detection-mass spectrometry (HPLC-DAD-MS) method was successfully applied to the simultaneous characterization and quantitation of 18 constituents in 28 Z. jujuba samples, comprised of 12 cultivars from different regions in China, by comparing their HPLC retention times, MS spectra, UV spectra, and NMR data with those of reference compounds. The quantitative method was validated with excellent linearity (R2 > 0.9991), preferable intra- and inter-day precisions (RSD < 2.78%), and good recoveries (94.96%–102.65%). The content variation of 18 compounds was analyzed by a chemometric method (hierarchical cluster analysis). In addition, these constituents showed protection against carbon tetrachloride (CCl4) intoxicated HepG2 cell lines by decreasing lactic dehydrogenase (LDH) levels. Results in this study illustrated that the content of all 18 compounds examined has significant difference and variation among cultivars and extracts. The proposed method can serve as a prerequisite for quality control of bioactive compounds in Z. jujuba products.

Reference:

WANG T Y, GUO S, REN X M, et al. Simultaneous quantification of 18 bioactive constituents in Ziziphus jujuba fruits by HPLC coupled with a chemometric method[J]. Food Science and Human Wellness, 2022, 11(4): 771-780. DOI:10.1016/j.fshw.2022.03.003.

编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片来源：图虫创意