王常勇/周瑾/那洁绘制人多谱系心脏类器官单细胞图谱

类器官是一类能在体外培养、模拟真实器官结构和生理功能的新型研究模型。近年来，科学家成功构建了脑、心、肝、肾、肺、胃、肠道、胰腺、视网膜等类器官模型，并在发育机理和疾病研究等方面取得了新的突破。以往研究显示，人诱导多能干细胞来源的心肌、血管内皮、平滑肌细胞结合组织工程支架形成的“心脏补丁”使心肌更加成熟，且移植入猪的心肌梗死模型后，显著促进了心脏修复(Ye et al., 2014)。但人们对不同类型细胞在形成类器官过程中如何相互作用，它们的状态和命运变化所知甚少，限制了心脏类器官在再生医学和药物研发中的应用。

2022年6月，军事医学研究院王常勇课题组与清华大学医学院那洁课题组合作在Life Medicine杂志在线发表了题为Single-cell atlas of multilineage cardiac organoid derived from human induced pluripotent stem cells的研究论文，从单细胞水平揭示了多谱系细胞形成心脏类器官过程中的细胞命运转变及潜在的基因调控机制。研究人员发现2D条件下人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）分化的心肌细胞（Cardiomyocytes, CM）与内皮细胞（Endothelial Cells, EC）以及平滑肌细胞（Smooth Muscle Cells, SMC）在3D细胞外基质（ECM）丰富的微环境中形成迷你心脏类器官（Mini-Cardiac Organoid, MCO），其中的细胞状态和组成会发生较大转变：心肌细胞进一步成熟，大量的未成熟的SMC转化形成高表达DLK1的成纤维细胞，赋予MCO特有的微环境，富集免疫调节信号，有利于对梗死心脏的修复。

研究人员从单细胞水平比较了单层分化的2D-CM、仅由CM构成的MCO-CM和由CM、EC、SMC构成的MCO-Mix。2D条件下hiPSCs分化的CM处于不成熟状态。而在富含ECM的3D微环境中培养的MCO-CM上调了心肌成熟、ATP能量代谢和肌肉收缩相关的基因，下调了心肌前体细胞的特征基因，说明3D微环境能大大促进心肌成熟。体内的心脏组织由多种细胞类型构成，研究人员进一步将hiPSCs分化的EC、SMC与CM混合构建出MCO_Mix。有意思的是，2周之后的MCO_Mix重置了初始细胞类型和比例，除成熟心肌细胞和内皮细胞外，出现了大量的DLK1+成纤维细胞。拟时序分析发现初始的非心肌细胞经过MCO_Mix构建后朝着成纤维细胞方向转变。

MCO_CM心肌细胞表达cTNT

迷你心脏类器官搏动的钙信号

心脏成纤维细胞对心脏的结构和功能有重要的调节作用。同样，成纤维细胞对MCO的性质也产生重要影响。研究人员通过配体-受体配对分析发现，MCO_Mix中DLK1-NOTCH信号通路基因表达急剧上调。为探究DLK1对MCO的作用机制，作者用可溶性DLK1（sDLK1）处理CM，转录组研究展示富集的KEGG通路包括细胞因子-受体相互作用，Toll样受体，RIG-I样受体，PPAR等信号通路以及补体和凝血级联，表明MCO_Mix中免疫调节潜能被激活。富集的GO与炎症反应调节，细胞外结构组织和损伤反应调节有关。

作者将这些MCO移植到心肌梗死（MI）大鼠心脏后，可以有效逆转病理重塑和改善心脏功能。MCO_CM移植组在梗死区显示出更高的人类心肌存活率，这可能是由于MCO_CM中心肌细胞比例较高所致。MCO_Mix组在改善心脏收缩功能和减少疤痕面积方面更具优势，这可能得益于DLK1+成纤维细胞抑制病理性纤维化和对炎症反应的调节，从而提升了梗死区细胞存活和心脏功能恢复。

总之，这项研究从单细胞水平详尽地解析了心脏类器官的演变过程，揭示了细胞命运和状态变化的基因调控网络，发现多种类型细胞混合互作后能产生新的细胞类型--DLK1+成纤维细胞，具备潜在的免疫调控和组织修复功能。这些发现为进一步优化hiPSC衍生的心脏类器官构建和心脏修复提供了新的线索。

军事医学研究院王常勇研究员和周瑾研究员为该论文共同通讯作者，军事医学研究院出站博士后张凤枝和清华大学医学院在读博士生邱辉为本文共同第一作者，清华大学医学院那洁副教授对本研究中干细胞体外诱导分化及单细胞数据分析提供了重要指导和鼎力支持。军事医学院研究院董晓惠，北京协和医院张晓燕博士，军事医学研究院王春兰，解放军总医院（301医院）转化医学中心李鑫，清华大学医学院在读博士生张兴武对本研究做出了重要贡献。

参考文献：

Ye, L., Chang, Y.H., Xiong, Q., Zhang, P., Zhang, L., Somasundaram, P., Lepley, M., Swingen, C., Su, L., Wendel, J.S., et al. (2014). Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell 15, 750–761.

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