RSV NS2 蛋白通过调节Beclin1 蛋白稳定化和ISGylation诱导自噬

呼吸道合胞病毒（Human Respiratory Syncytial Virus，RSV）是引起婴儿、老年人和免疫功能低下患者病毒性肺炎的主要病原。2015 年，全球约有 320 万因急性下呼吸道感染而住院的 5 岁以下儿童因 RSV。临床批准和有效的治疗选择很少，预防性单克隆抗体（即帕利珠单抗）和抗病毒化合物（如利巴韦林）显示出不同的临床结果。目前没有批准上市的疫苗。因此，了解宿主-病毒相互作用是控制 RSV 改变免疫反应能力的机制必要手段，对于开发有效的治疗和预防干预措施至关重要。

近期，由美国华盛顿州立大学兽医学院兽医微生物学和病理学系Santanu Bose教授实验室在mBio杂志（中科院分区一区，影响因子7.867）发表了题为“Human Respiratory Syncytial Virus NS2 Protein Induces Autophagy by Modulating Beclin1 Protein Stabilization and ISGylation”的研究论文。RSV非结构蛋白 NS2 促进 Beclin1 的低 ISG 化，以确保活性 Beclin1参与自噬过程。

RSV 的非结构 (NS) 蛋白NS1和NS2能调控天然免疫反应，但对于细胞自噬方面机制尚不清楚。作者首先验证了NS1和NS2蛋白对细胞自噬影响，结果发现NS2蛋白上调LC3表达，且免疫荧光观察NS2蛋白能够诱导LC3斑点化。同时，细胞自噬抑制剂巴弗洛霉素 A能显著性增加NS2诱导的LC3积累。表明了NS2蛋白诱导细胞自噬。

Beclin1 是自噬的基本正向调节因子，它通过与其他核心蛋白的相互作用介导自噬启动期间 VPS34-VPS15-Beclin1-ATG14复合物的组装。NS2基因靠近 RSV基因组转录起始位点（即 RSV 基因组的 3' 端），最先被翻译出来的蛋白之一。在RSV进入细胞后，能够从蛋白水平上调Beclin1表达，说明RSV早期表达基因诱导了细胞自噬发生，因此在 RSV 感染期间表达的 NS2 蛋白增强了 Beclin1 蛋白水平以诱导自噬。为了深入研究 NS2诱导的自噬机制，作者通过免疫共沉淀实验发现NS2蛋白与Beclin1蛋白相互作用，且免疫荧光观察发现NS2蛋白与Beclin1存在共定位。Beclin1是由BH3、卷曲螺旋结构域 (CCD) 和进化保守结构域 (ECD)三个功能不同的结构域组成，并且作者发现Beclin1三个结构域均能与NS2蛋白存在相互作用。

过表达NS2蛋白能显著增强Beclin1蛋白表达。使用细胞用蛋白质合成抑制剂放线菌酮 (CHX; 75 μg/mL) 处理细胞后，发现NS2 通过阻止其在翻译抑制条件下的降解来稳定 Beclin1 蛋白。Beclin1 蛋白在表达 NS2 的 A549 细胞中始终检测到较高水平，甚至在蛋白合成关闭 8 小时后，也比在载体对照中检测到更高水平。表明了NS2 蛋白的表达通过阻止 Beclin1 蛋白的降解来稳定它。泛素介导的蛋白酶体降解是参与 Beclin1 蛋白质周转的主要蛋白质降解途径。作者使用蛋白酶体抑制剂 MG-132 研究 NS2是否影响蛋白酶体降解。用 MG-132 处理共表达 Beclin1 和 NS2 的 A549 细胞或载体（对照），并通过免疫印迹法测定 Beclin1 蛋白的水平。结果发现在用蛋白酶体抑制剂处理的 NS2 表达细胞中，Beclin1 水平翻了一番（P <0.05），而在处理的对照细胞中没有观察到显着变化。这些结果表明 NS2 通过减少蛋白酶体介导的Beclin1 降解来增强 Beclin1 的稳定性，从而提高 Beclin1 的水平。

为了剖析 NS2 蛋白在 RSV 感染期间自噬诱导中的直接作用，作者使用了重组野生型 RSV和缺失 NS2 基因的突变型RSV，结果发现野生型RSV能够诱导细胞自噬，促进LC3I向LC3II转变，而缺失NS2基因的RSV感染后，这种转变显著减少或者不存在，表明 NS2 在 RSV 感染期间在自噬诱导中起关键作用。同时，也检测了Beclin1蛋白表达，结果发现缺失NS2基因的RSV感染细胞后，没有引起Beclin1蛋白变化，说明了NS2在RSV感染期间增强Beclin1蛋白表达，促进细胞自噬。

蛋白质ISGylation由干扰素刺激基因 15 (ISG15) 与其蛋白质靶标的共价结合组成。Beclin1通过在 Lys117、Lys263、Lys265 和 Lys266 处与 ISG15 或泛素 (Ub) 结合来调节。Beclin1 在这些位点的Lys63 连接的多泛素化对于自噬激活至关重要。已有研究表明ISG15 与 Ub 竞争抑制 Beclin1 介导的自噬，使 ISGylation 成为 Beclin1 介导的自噬的负调节因子。虽然 RSV 感染会诱导 ISG 化，但 RSV 必须能够克服这种“抗自噬”效应，因为感染会诱导自噬。作者研究发现，过表达NS2蛋白能减少ISGylation形成，NS2 会损害Beclin1的ISGylation，这可能代表了一种确保激活可用的 Beclin1 以诱导自噬的机制。

这篇文章研究RSV 非结构蛋白 NS2 与自噬前调节因子 Beclin1 相互作用并使其稳定。NS2-Beclin1 相互作用增加了 Beclin1 蛋白水平，并通过破坏 Beclin1 蛋白 ISG 化使其可用于自噬。对了解控制 RSV 操纵免疫反应能力的机制对于开发针对宿主的治疗和预防干预措施很有价值.

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