SARS-CoV-2 感染增强线粒体 PTP 复合物活性以扰乱心脏能量

SARS-CoV-2 感染细胞能诱导线粒体自噬，造成PINK1表达增多以及Parkin在线粒体聚集，并且发现自噬受体P62在线粒体聚集增多。通过也有文章研究报道，SARS-CoV-2 M蛋白和ORF10蛋白可以诱导线粒体自噬。这些结果均说明了SARS-CoV-2 能作用于线粒体，然而，SARS-CoV-2 是如何影响线粒体功能稳定的，尚不清楚。

近日，美国德克萨斯大学圣安东尼奥分校Muniswamy Madesh团队，在《iScience》杂志上，发表一篇“SARS-CoV-2 infection enhances mitochondrial PTP complex activity to perturb cardiac energetics”

作者对人类 PBMC 进行了转录组分析，确定了线粒体、离子通道和蛋白质质量控制基因产物的显着变化。

首先，作者收集未感染SARS-CoV-2的健康人类样品、轻度患者和重度患者的PBMC细胞样品，提取RNA进行转录组测序，结果发现线粒体复合物、离子通道亚基以及自噬相关基因的表达具有显著性差异。肌钙蛋白-C、proBNP 和 LDH等心肌损伤标记蛋白也出现显著升高，表明了这些患者有急性心脏损伤的表现。

为研究SARS-CoV-2感染细胞后，造成的线粒体变化，作者在COS-7 细胞中克隆并表达了 29 种 SARS-CoV-2 蛋白中的 13 种带有 mRFP/FLAG 标记的蛋白，以检测它们的细胞分布和定位。结果发现 Orf9C、M 蛋白、Nsp6 和 Orf3a等四种蛋白定位于 ER 或线粒体膜，Nsp7表现出ER重塑并在质膜附近迁移。这些结果表明，病毒复制和结构性 SARS-CoV-2 蛋白除了具有典型功能外，还靶向宿主细胞器。

转录组测序结果发现，具有严重感染 COVID-19 患者的 PBMC 中，核和线粒体基因组编码的转录本都发生了显着改变，可能是由于严重影响 COVID-19 患者的结果包括器官衰竭和死亡。由于作者我们专注于促进细胞死亡和线粒体功能障碍的候选基因。在这些转录本中，先前未表征的 CCDC58 在从 COVID-19 患者获得的 PBMC 中显着升高。基于 mitoCarta 和 Mito-miner 数据库，预测 CCDC58靶向线粒体区室，为了评估其定位，将带有 C 端 FLAG 标记的 CCDC58 与线粒体标记蛋白 COX8A-mRFP 共转染。正如预测的那样，免疫荧光分析证实 CCDC58 主要定位于线粒体，并且与 COX8A几乎完全重叠。据报道，高通量 RNAi 介导的线粒体驻留蛋白（包括 CCDC58）沉默导致线粒体 Ca 2+保留能力增加，这表明线粒体 Ca 2+超载与细胞死亡之间存在联系。因此，作者确定了 CCDC58的稳定对是否会产生对 Ca 2+诱导的线粒体通透性转变孔开放的具有调节作用。因此，作者使用含有洋地黄皂苷的细胞内培养基对稳定转染的对照和 CCDC58 KD 293T 细胞进行实验，发现沉默CCDC58 显着增加了线粒体 Ca 2+保留能力，并且还具有更高的耗氧率 (OCR)，但细胞 ATP 水平降低。沉默CCDC58 后，细胞仍部分保留钙黄绿素，表明 CCDC58 可能参与 mPTP 复合物。在观察到在 COVID-19 疾病发展下 CCDC58 升高后，作者接下来验证 SARS-CoV-2 M 蛋白是否靶向 CCDC58 蛋白以改变线粒体功能。为了验证这一点，作者在沉默CCDC58的细胞中重组 M 蛋白并检测CRC，发现缺乏 CCDC58 的细胞能够维持 CRC，这突出了 CCDC58 在 COVID-19 诱导的线粒体功能障碍中的关键作用。

在观察到COVID-19 患者线粒体能量学 CCDC58 和 Ca 2+依赖性功能变化的显著性升高后，作者为了鉴定与线粒体中的 SPG7 结合的 SARS-CoV-2 蛋白，利用了 SARS-CoV-2 的 C 末端血凝素 (HA) 标记的亲环蛋白 D (PPIF) 或 SPG7 和 FLAG 标记的 13 个基因。将这些质粒共转染后，发现这些蛋白存在大量的异位表达。将这些单个基因与 COS-7 细胞中的亲环蛋白 D 或 SPG-7 瞬时共转染，并用 HA抗体对细胞裂解物进行免疫共沉淀，结果发现HA 标记的 SPG-7 与 NSP6、M 蛋白、ORF3a、ORF9b、ORF9c 和 ORF10 存在相互作用，而亲环蛋白 D 与 NSP6、M 蛋白、ORF3A、ORF9b 和 ORF10 也存在相互作用。接下来，作者使用 CCDC58 与 FLAG 标记的 13 种病毒蛋白共转染，使用 Myc 特异性抗体 (CCDC58) 将 NSP6、M 蛋白、ORF3A、ORF9c、ORF9b 和 ORF10 拉下，说明存在相互作用，并且作者还通过反向验证，也验证了这些蛋白存在相互作用。由于 沉默CCDC58 导致线粒体 Ca 2+保留能力增加，作者检测 PPIF 和 SPG7 是否与 CCDC58具有相互作用。用 CCDC58/PPIF 或 CCDC58/SPG7 质粒共转染 COS-7 细胞，结果发现CCDC58 在 COS-7 细胞中的异位表达并与 SPG7 和 PPIF 存在极为显著的相互作用，表明 CCDC58 与 SPG7 相互作用是由于其定位于线粒体膜间隙。

此外，作者还研究了 SARS-CoV-2 蛋白与 ANT 和 ATP 合酶的相互作用，发现SARS-Cov-2 质粒在 COS-7 细胞中异位表达，并通过免疫沉淀与 SPG7、ANT、ATP 合酶结合，SARS-CoV-2 蛋白总是与人类 mPTP 复合物成分相互作用。总的来说，这些结果表明 SARS-CoV-2 蛋白靶向多个细胞器，特别是线粒体，它选择性地与 mPTP 复合物成分相互作用。

作者通过转录组数据分析，发现具有严重感染 COVID-19 患者的 PBMC中的自噬/线粒体自噬标志物显着升高。接下来，作者验证了SARS-CoV-2 病毒感染是否会重组人 iPSC 衍生心肌细胞中的细胞骨架装置和 ER 网络。作者使用心肌细胞在微管蛋白-GFP 和 Sec61b-mCherry 腺病毒构建体 (AdV5a) 中异位共表达，并使用共聚焦成像对结构进行可视化。正如预期的那样，肌细胞显示出精心设计的细胞骨架和 ER 隔室。SARS-CoV-2 感染 24 小时后，细胞骨架和 ER 网状网络均崩溃。在观察到活的 SARS-CoV-2 病毒会引起细胞应激后，作者又检测病毒对细胞质量控制机制的影响。为了评估自噬是否受到病毒感染的影响，我们使用表达串联 LC3（轻链 3）-GFP（绿色荧光蛋白）-RFP（红色荧光蛋白）报告基因的腺病毒监测 SARS-CoV-2 感染后心肌细胞中的自噬通量。绿色斑点表示自噬体形成，而红色斑点表示自噬溶酶体形成。在溶酶体的酸性环境中，GFP 信号被淬灭。这些数据表明，病毒感染会加剧自噬通量，这可能会消除大量功能失调的线粒体。

接下来作者检测病毒蛋白是否会改变线粒体生物能量学并可能诱导心肌细胞死亡。作者在HEK293T细胞中过表达病毒蛋白，检测线粒体耗氧率 (OCR)，结果发现 M 蛋白或 ORF3a具有较低水平的 OCR 和最小 FCCP 诱导最大 OCR。有趣的是，NSP6 和 NSP7 表现出对最大 OCR 的部分抑制。然而，这些细胞类型的 ECAR（细胞外酸化率）相似。尽管 OCR 受到这些病毒蛋白的影响，但这些细胞是有活力的，表明从氧化表型转变为糖酵解表型。为了进一步研究病毒蛋白对线粒体离子稳态的影响，作者测量了透化细胞系统中的 MCU 通道活性以及线粒体 CRC，发现 SARS-CoV-2 蛋白的异位表达降低了 CRC；但MCU 活动保持不变。作者接下来评估了 mPTP 阻滞剂环孢菌素 A 是否在病毒蛋白表达条件下恢复 CRC。正如预期的那样，CsA 增强了线粒体 CRC，但仍观察到病毒 M 蛋白介导的 CRC 减少。除 NSP7 外，这些病毒蛋白的重组表现出较低的 CRC。最后，作者评估了病毒感染下的心肌细胞活力，感染后 24 小时，使用 MTT 测定法评估心肌细胞活力。感染病毒的心肌细胞表现出显着的细胞死亡，而环孢菌素 A 治疗可以显着防止这种死亡，这表明这些病毒颗粒/蛋白质可以通过 mPTP 开放和最终的心肌细胞损伤破坏线粒体生物能。

由于有效的 Ca 2+循环对于心肌细胞的收缩和舒张至关重要，所以作者首先测试了 hiPSC-CM 中的自发 Ca 2+循环。在对照 hiPSC-CM 中观察到较高的 Ca 2+循环，但这种有节奏的 Ca 2+循环在表达 SARS-CoV-2 M 蛋白的 hiPSC-CM 中受到干扰。尽管 Ca 2+振幅相似，但在表达 SARS-CoV-2 M 蛋白的 hiPSC-CM 中，舒张期 Ca 2+的浓度和频率显着延长。类似地，NSP-6 的过表达在振幅和 Ca 2+循环中都表现出显着的破坏，表明病毒蛋白对心肌细胞 Ca 2+循环的损害可能会改变力的产生。使用不同膜电位下的细胞处理，发现在对照 hiPSC-CM 中存在 L 型 Ca 2+电流，hiPSC-CM 表现出电流-电压 (I/V) 特性和硝苯地平对 Ca v 1.2 通道 (LTCC) 的抑制作用。观察到 Ca 2+循环的扰动后，我们在 hiPSC-CM 中异位表达 SARS-CoV-2 M 蛋白、ORF-9c、ORF-3a、NSP-6 和 NSP-7。这些病毒蛋白导致 Ca v 1.2 电流显着抑制。总的来说，这些结果表明 SARS-CoV-2 病毒蛋白会破坏心肌细胞 Ca 2+循环和离子通道活性。

总之，作者研究表明，SARS-CoV-2 蛋白定位于线粒体，与 mPTP 复合物结合，改变线粒体形态和功能，破坏 Ca 2+循环并抑制 VDCC 通道活性。并且通过研究作者推测了 COVID-19 引起的心脏损伤可能是由于线粒体功能障碍。此外，这些综合分析指出了新的药物靶点，以保护宿主细胞免受 SARS-CoV-2 诱导的心脏损伤。具体来说，作者的结果表明，mPTP 阻滞剂和免疫抑制药物环孢菌素 A可能为治疗 COVID-19 患者提供额外的治疗选择。

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