民族药理-广东工大等揭示豆蔻属精油对脂多糖致急性肺损伤小鼠的保护作用及其代谢组学

编译：微科盟草重木雪，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

几种豆蔻属植物通常在食品中作为调味剂和中药用于治疗炎症相关疾病。本研究旨在探讨包括六种豆蔻属精油(AEO)在内的中草药对脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肺损伤(ALI)的保护作用。本研究采用气相色谱-质谱联用技术分析了AEOs的组成。RAW264.7细胞用AEOS (0-100 μg/mL)处理并用LPS刺激。C57小鼠通过雾化系统连续7天接受AEOs（100 mg/kg），然后气管内滴注LPS建立急性肺损伤体内模型。本研究发现三种AEOs表现出了抗炎作用和LPS诱导的肺组织病理损伤的改善；这些AEOs降低了LPS诱导的ALI小鼠支气管肺泡灌洗液中的肺湿/干重比和蛋白浓度。此外，AEOs降低了丙二醛、TNF-α、IL-6和IL-1β的水平，但增加了肺组织、肺泡灌洗液和血清样品中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的水平，影响与TLR4/Myd88/NF-κB通路相关的蛋白。本研究结果表明，AEOs通过TLR4/Myd88/NF-κB通路改善了ALI小鼠的炎症和氧化应激。

论文ID

原名：Protective effect of Amomum Roxb. essential oils in lipopolysaccharide-induced acute lung injury mice and its metabolomics

译名：豆蔻属精油对脂多糖致急性肺损伤小鼠的保护作用及其代谢组学

期刊：Journal of Ethnopharmacology

IF：4.360

发表时间：2022.02

通讯作者：张蓝月， 郑希

通讯作者单位：广东工业大学&美国罗格斯大学

实验结果

1. AEOs的化学组成

为了确定豆蔻属的保护作用，我们对6种豆蔻属精油的成分进行了分析。豆蔻属样品的凭证样本编号、采集时间、产地、样本存放地点见附表1。我们使用GC-MS分析AEOs的组成。

图1 AEOs对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症的影响

AEOs对(A)细胞活力；(B) LPS诱导的NO产生；(C) LPS诱导的ROS产生；(D) LPS诱导的TNF-α、IL-1B和IL-6的表达；(E) LPS诱导的iNOS和COX-2在RAW264.7细胞中的表达的影响。数据表示为平均值±SD（每组n = 3）。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P <0.001，和****P < 0.0001相较于LPS组。

2. AEOs对LPS诱导RAW264.7细胞炎症反应的影响

为评价AEOs的抗炎作用，本研究采用LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型。首先，我们采用MTT法测定6个AEOs的细胞毒性(图1A)。在100 μg/mL的浓度下，S1、S4、S5和S6对RAW264.7细胞（即单核细胞/巨噬细胞样细胞）的增殖没有显著影响。另一方面，S2和S3对RAW264.7细胞的毒性是浓度依赖性的，在浓度大于25 μg/mL时导致细胞活力显著降低（P < 0.05）。因此，在随后的抗炎活性实验中，我们对S1、S4、S5和S6使用100 μg/mL的浓度，对S2和S3使用12.5 μg/mL的浓度。

RAW264.7细胞为巨噬细胞，可产生炎症介质和细胞因子(NO、iNOS、TNF-α、IL-6等)。在LPS刺激后，RAW264.7细胞产生NO、ROS和炎性细胞因子，导致炎症级联反应。因此，我们用LPS刺激RAW264.7细胞建立炎症模型，并测量细胞内炎症介质NO（图1B）和ROS（图1C）的水平。LPS诱导后各AEO组均显著降低NO和ROS水平（P < 0.05），表明AEOs可能抑制RAW264.7细胞的炎症和氧化应激。

然后我们使用ELISA方法测定RAW264.7细胞中细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。如图1D所示，每个AEO组在LPS诱导后显著降低细胞因子水平（P < 0.05），其中S1、S4和S6表现出强抑制作用。由于COX-2和iNOS是与炎症密切相关的NF-κB信号通路中的下游蛋白，我们使用蛋白质印迹法测量了它们的表达（图1E）。S1、S4和S6处理组iNOS和COX-2蛋白的表达水平低于其他组。基于这些实验结果，我们仅选择了六种AEOs中的三种，即S1、S4和S6，用于进一步的体外和体内实验。

图2 AEOs对LPS刺激的RAW264.7细胞TLR4/Myd88/NF-κB信号通路的影响

(A) AEOs对LPS刺激的RAW264.7细胞中p65蛋白的免疫荧光结果。(B) AEOs对LPS刺激的RAW264.7细胞中TLR4、Myd88和pp65蛋白的影响。数据表示为平均值±SD（每组n = 3）。*P < 0.05, **P < 0.01, * **P <0.001，和****P < 0.0001相较于LPS组。

3. AEOs对LPS刺激RAW264.7细胞TLR4/Myd88/NF-κB通路的影响

LPS特异性结合巨噬细胞细胞膜上的TLR4，通过NF-κB通路启动细胞内信号转导，导致细胞因子和促炎介质的产生。为了评估NF-κB通路的激活状态，我们通过免疫荧光实验测定LPS刺激后RAW264.7细胞中p65的核位移(图2A)。此外，我们使用蛋白质印迹法检测了RAW264.7细胞中TLR4、Myd88、pp65和p65的蛋白质表达水平（图2B）。免疫荧光结果显示，与对照组相比，LPS组的p65主要位于细胞核内。而AEO组p65核位移显著降低，提示AEO介导的NF-κB信号通路抑制。蛋白质印迹数据显示S1、S4和S6降低了LPS刺激的RAW264.7细胞中TLR4、Myd88和pp65的蛋白水平。基于这些实验结果，我们选择了S1、S4和S6进行后续的体内动物实验。

图3 AEOs对LPS刺激的C57小鼠肺组织病理变化和氧化应激的影响

(A) HE染色观察肺组织病理变化。(B)肺组织的湿重/干重比。(C) BALF中的蛋白质浓度。（D-E）免疫组织化学结果显示用AEOs处理的LPS诱导ALI小鼠肺组织中的MPO。（F-H）使用MDA、SOD和CAT检测试剂盒分析LPS诱导的ALI小鼠肺组织中的MDA、SOD和CAT含量。数据表示为平均值±SD（每组n = 3）。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P <0.001, and ****P < 0.0001相较于LPS组。

4. AEOs对LPS诱导ALI所致肺组织病理改变和氧化应激的影响

苏木精和伊红染色用于对LPS诱导的ALI模型的肺组织进行组织学分析，并检测任何潜在的组织病理学异常。如图3A所示，S1、S4和S6减少了肺组织中的中性粒细胞浸润和肺泡壁厚度。此外，我们测量湿(W)和干(D)肺重量，并在AEOs处理后收集支气管肺泡灌洗液。与对照组相比，LPS组的W/D比和BALF中的蛋白质浓度显著增加，而AEO组显著降低（P < 0.05）。这一发现表明，S1、S4和S6可以减少ALI小鼠肺组织中的肺水肿、血管通透性和蛋白质浸润（图3B和C）。

组织中中性粒细胞增多是氧化损伤的指标，而MPO是中性粒细胞浸润的重要指标，在组织损伤和炎症中起重要作用。为了评估中性粒细胞介导的氧化应激，我们使用免疫组织化学方法测量了肺组织中的MPO含量（图3D和E）。AEO组染色强度明显低于LPS组（P < 0.05）。

此外，我们评估了常用于评估氧化应激的MDA、CAT和SOD的水平。如图3F-H所示，LPS处理导致MDA水平显著升高，SOD和CAT水平显著降低（P <0.05）。相反，AEO组显示MDA降低，CAT和SOD水平升高。总体而言，S1、S4和S6通过下调氧化应激标志物和增加抗氧化酶发挥抗氧化活性。

图4 AEOs对LPS处理的C57小鼠肺组织、BALF和血清样本中细胞因子的影响

ELISA用于检测(A)肺组织、(B) BALF和(C)血清样品中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平。数据表示为平均值±SD（每组n = 3）。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，和****P < 0.0001与LPS组比较。

5. AEOs对LPS诱导ALI小鼠炎症反应的影响

炎症和细胞因子在ALI的发生发展中起重要作用。为了进一步评估AEOs对LPS诱导的ALI小鼠细胞因子的影响，我们使用ELISA测量肺组织、BALF和血清样本中TNF-α、IL-1B和IL-6的水平(图4A，肺组织；图4B，BALF；图4C，血清)。S1、S4和S6显著降低ALI小鼠细胞因子的表达水平（P < 0.05），表明它们的抗炎反应涉及细胞因子抑制。

图5 AEOs在LPS诱导的ALI的C57小鼠肺组织中诱导TLR4/Myd88/NF-κB信号通路

Western blotting检测LPS诱导的ALI小鼠肺组织中TLR4、Myd88、iκBα、p-iκBα、p65和p-p65蛋白的表达水平。数据表示为平均值±SD（每组n = 3）。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P <0.001，和****P < 0.0001相较于LPS组。

6. AEOs抑制TLR4/Myd88/NF-κB信号通路

为了研究AEOs对ALI的潜在保护机制，我们采用蛋白质印迹法检测参与TLR4/Myd88/NF-κB信号通路的蛋白质的表达。与LPS组相比，S1、S4和S6组显著抑制了TLR4、Myd88、p-IκB和p-p65的蛋白表达（图5）。结果表明，S1、S4和S6抑制TLR4/Myd88/NF-κB信号通路的激活。

图6 AEOs对LPS诱导的ALI小鼠血清的代谢分析

(A)全扫描模式下组间的PCA图。(B)全扫描模式下组间的PLS-DA图表。(C) 15种显著不同的代谢物的热图分析。（D-F）与显著不同的代谢物有关的丰富代谢途径。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，和****P < 0.0001与LPS组相比较。

7. AEOs对LPS诱导ALI小鼠的代谢分析

为了进一步研究AEOs对ALI的保护机制，我们使用HRAM LC-MS/MS平台进行血清代谢组学分析。我们对原始数据进行了无监督主成分分析（PCA）、监督偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和对潜在结构判别分析（OPLS-DA）的正交投影（图6A-C），对照组和LPS组明显分开。此外，S1、S4和S6组与LPS组明显分开，表明AEOs预处理显著影响血清代谢物。

变异对投影(VIP)值的影响 > 1和p < 0.05被用作识别显著不同代谢物的标准。我们使用CompoundDiscoverer 2.1 和SIMCA软件（补充材料表8）鉴定了15种显著不同的代谢物。接下来，我们对这15种显着不同的代谢物进行了热图分析（图6D）。为了识别与ALI相关的代谢途径，我们将显著不同的代谢物导入 MetaboAnalyst 5.0在线分析平台，产生15条可能相关的代谢途径（图6E-G）。这些途径涉及亚油酸代谢；苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成；不饱和脂肪酸的生物合成和苯丙氨酸代谢。因此，LPS诱导的ALI可能与这些途径有关。此外，炎症和氧化应激也与这些途径密切相关，表明S1、S4和S6可能通过这些代谢途径对ALI发挥保护作用。

ALI的高发病率和死亡率对公众健康构成严重威胁。此外，ALI可由肺炎和败血症引起的吸入烟雾等因素诱发。然而，ALI的有效治疗方法仍有待开发。建立适当的实验模型有利于研究这种疾病的发病机制和确定新的治疗方法。通过气管滴注LPS被认为是ALI建模的常用方法。

根据以前的报道，豆蔻属植物表现出抗炎和抗氧化应激作用。AEOs的主要成分包括醋酸冰片酯、樟脑、(+)-瓦伦烯、桉叶素和(+)-柠檬烯。根据以往的研究，醋酸冰片酯可通过抑制TNF-α和IL-1β的产生发挥抗炎作用，并可通过促进IL-11的表达来抑制人骨关节炎；(+)-瓦伦烯可抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中 iNOS的表达和NO的产生；桉叶素可减轻β淀粉样蛋白中毒 PC12 细胞中的炎症；(+)-柠檬烯可以通过调节氧化应激和炎症反应来获得胃保护。在我们的研究中，我们发现六种AEOs（标记为S1-S6）显示出抗炎作用，三种AEOs（S1、S4S6）显示出对LPS诱导的ALI的预防作用。

据报道，炎症和氧化应激在ALI中起关键作用。在LPS诱导的ALI中，巨噬细胞被激活，导致促炎细胞因子的释放和肺组织的损伤。我们的研究结果表明，六种AEOs影响RAW264.7 巨噬细胞，并在降低NO、TNF-α、IL-1B和IL-6的表达方面显示出抗炎作用。此外，我们还发现AEOs抑制了ROS的产生并表现出抗氧化特性。此外，本研究发现AEOs在LPS刺激后降低了RAW264.7细胞中的TLR4、Myd88 和p65水平。TLR4通常在巨噬细胞、树突状细胞和其他类型的免疫细胞中表达。此外，TLR4相关信号通路在免疫细胞激活中发挥重要作用。我们的数据表明，AEOs可能通过影响TLR4/Myd88/NF-κB信号通路发挥抗炎作用。

ALI的特点是肺组织水肿和肺泡通透性增加，肺组织的W/D比和BALF中的蛋白浓度反映了这一点。我们的研究结果表明，S1、S4和S6可以显著降低肺组织中的ALI表型和病理损伤。这些结果表明，AEOs可减轻LPS诱导的小鼠ALI。细胞因子，如 TNF-α、IL-β和IL-6，通过中性粒细胞和巨噬细胞的激活而释放。此外，TLR4/Myd88/NF-κB信号通路的激活也会导致细胞因子的释放。因此，为了进一步研究AEOs的抗炎作用，我们研究了LPS诱导的ALI小鼠中细胞因子的表达。结果表明，经AEOs治疗的ALI小鼠中TNF-α、IL-β和IL-6水平显著降低。此外，我们还研究了肺组织中氧化应激指标（MDA、SOD和CAT）的表达，发现AEOs降低了MDA的表达，但增加了抗氧化酶SOD和CAT的表达，表明肺组织ALI小鼠的氧化反应受到抑制。以上结果表明S1、S4和S6能够抑制ALI小鼠的炎症反应和氧化应激。

以往的研究表明，TLR4/Myd88/NF-κB通路与ALI密切相关。TLR4在识别革兰氏阴性菌中起重要作用。此外，TLR4和Myd88的激活导致肺中NF-κB通路的激活。在我们的研究中，我们发现在RAW264.7细胞中，AEOs抑制iNOS和COX-2的表达，它们是TLR4/Myd88/NF-κB通路的下游蛋白。此外，我们的体内实验表明AEOs能够降低NO、TNF-α、IL-β和IL-6的水平。

LPS刺激肺部并引起炎症和氧化应激。本研究中，血清代谢组学分析表明，脂质和氨基酸代谢受LPS诱导的ALI影响，其中亚油酸/花生四烯酸相关通路受影响。亚油酸是花生四烯酸的前体，可转化为各类免疫调节分子。具体而言，脂质介质白三烯B4与炎症和氧化应激有关。在LPS组中，我们发现白三烯B4的含量明显增加。然而，我们还发现AEOs显著降低了白三烯B4的表达，表明AEOs通过调节亚油酸和花生四烯酸的代谢来抑制ALI引起的炎症反应和氧化应激。此外，我们还检测到酰胺-tRNA生物合成代谢途径的变化。酰胺-tRNA生物合成是一个与LPS诱导的炎症相关的过程，因为它可以触发TNF-α通路并激活相关通路。我们确定了碱基-tRNA生物合成途径中的酰胺变化，表明AEOs通过该代谢途径抑制ALI的炎症反应。然而，这项研究有一些局限性。例如，我们的实验主要集中在炎症和氧化应激两个方面，而没有研究AEOs对细胞凋亡的影响，而细胞凋亡在LPS诱导的ALI中起重要作用。因此，需要进一步研究AEOs在调节LPS-ALI细胞凋亡中的作用。

综上所述，我们发现AEOs可以减轻ALI小鼠肺组织的炎症和氧化应激。这些作用可能与TLR4/Myd88/NF-κB信号通路有关。

原文链接： https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35182669/