自然界本身就具有二氧化碳的生物转化利用能力。目前，在好氧和厌氧生物中已经发现了六种天然的生物固碳途径，包括广泛存在于植物和藻类中的卡尔文循环（光合作用中的暗反应即固碳反应）在内。
然而，这些天然固碳途径的步骤较长（大多包含十几步生化反应），即便在微生物中实现这些天然固碳途径的异源重构，由于并没有改变固碳途径的基本结构，仍然不能实现二氧化碳的快速高效生物转化。
一般情况下，反应步骤越多，效率就越低。为了进一步缩短生物固碳途径的反应步骤，提高固碳效率，中国科学院微生物研究所李寅研究员课题组基于生化反应热力学和动力学计算，历时五年设计出目前最小化的、仅有四步反应的人工固碳循环。
目前，这项研究成果已于去年 12 月 28 日以 “A Minimized Synthetic Carbon Fixation Cycle” 为题发表在 ACS Catalysis 上。这项研究不仅为二氧化碳的人工生物转化开辟了全新途径，同时也为探索地球早期生物如何进行二氧化碳固定提供了新的模型。
图｜发表的论文（来源：ACS Catalysis）
酶和能量是缩短固碳循环的关键
所谓固碳，就是把无机碳转化成有机碳，固碳的过程本质上是一个氧化还原反应。“由于二氧化碳中的碳处于比较高的价态（+4 价），而有机碳中的碳处于比较低的价态，因此，需要较大的还原力，才能推动这个反应发生。” 论文第一作者、中国科学院微生物研究所肖璐博士告诉生辉。
2014 年，肖璐在湖南大学本科毕业后被保送中科院微生物所读直博，博士期间她主攻酶工程和合成生物固碳方向。去年年底，她博士毕业，接下来将继续在合成生物学领域进行博士后研究工作。
图｜肖璐博士所在的李寅研究员课题组（来源：受访者）
“在 POAP 循环中，我们使用的是丙酮酸合酶。” 她表示。一般情况下，丙酮酸合酶（PFOR）催化的是丙酮酸氧化脱羧，是一个释放二氧化碳的反应。“若想在 POAP 循环中利用丙酮酸合酶固碳，需要将丙酮酸氧化脱羧反应逆转，催化乙酰辅酶 A 还原羧化生成丙酮酸。但这个反应需要较高的还原力推动，我们采用的方式为在厌氧条件下利用低电势的电子供体提供足够的还原力来驱动反应。”
据介绍，肖璐在研究期间，通过测试一系列低电势的电子供体铁氧还蛋白（Fd），发现来源于嗜热氢杆菌的 Fd2 对丙酮酸合酶的还原羧化反应具有较强的推动作用，以 Fd2 作为电子供体，可以驱动热纤梭菌来源的丙酮酸合酶实现乙酰辅酶 A 的还原羧化。
图｜POAP 循环（来源：论文）
如上图所示，POAP 循环的四步反应分别由丙酮酸羧化酶（PYC）、草酰乙酸乙酰基水解酶（OAH）、乙酸 - CoA 连接酶（ACS）、丙酮酸合酶（PFOR）分别进行催化，这四种酶的首字母组成了 “POAP”，这就是 POAP 循环名称的由来。
在这四步反应中，由丙酮酸合酶和丙酮酸羧化酶催化的这两步反应均为固碳反应。POAP 循环每运行一轮，可以转化两分子二氧化碳生成一分子草酸，消耗两分子 ATP 和一分子还原力。据了解，POAP 循环可以在无氧环境和较高温度（50°C）下实现二氧化碳固定，试验测得 POAP 循环的固碳速率为 8.0±1.8 nmol CO₂/min/mg 酶，总转换数为 5 mol 草酸 /mol 酶。
相较于传统工业固碳的实现条件极为苛刻（比如需要高温高压），生物固碳的实现条件则要 “温和” 得多。“但随之而来的代价是步骤非常多，需要一步一步地进行还原。所以，想要缩短生物固碳途径，就意味着一步反应需要实现长固碳途径中多步反应的功能。” 肖璐指出。
据介绍，想要设计出更短的人工固碳循环，首先需要找到合适的酶；其次，固碳途径 “长步骤” 是按部就班地进行一步步反应（逐渐吸收能量），而变为 “短步骤”，则需要更高的能量来进行驱动。所以，“酶” 和 “能量” 是缩短固碳循环的两个关键点。
除此之外，丙酮酸合酶属于厌氧酶，其在大肠杆菌中异源表达、组装、纯化也比较困难。“我们做了很多表达纯化的条件优化，最后选择了嗜热菌来源的丙酮酸合酶，因为其反应温度比较高，使得这个反应更容易发生。” 肖璐说道，“然后又尝试了很多天然和人工合成的电子供体，找到了比较适合的电子供体来推动这个反应的发生。最终，实现了将原来十几步反应缩短为四步。” 她补充道。
理论层面，构成一个最小固碳循环需要三步反应，而 POAP 循环只含有四步反应，接近理论最小值，也是目前经过实验证实的最小化的人工固碳循环。“缩短人工固碳途径不但能够提高固碳速率，同时还使得固碳过程更为简单，所采用的酶种类更少，反应的条件也更容易匹配。” 肖璐指出。
谈及下一步的研究方向，肖璐表示，大的方向依然还是针对固碳领域，细分的方向，比如设计和构建新的固碳循环，以及运用合成生物学的手段对酶进行基因改造，对酶的结构进行解析，然后进行优化、改造和筛选等。
人工固碳循环效率已超过天然途径
在肖璐看来，全球层面人工固碳研究中，有两大具有代表性的里程碑事件：CETCH 循环和ASAP 途径。
2016 年，德国马普陆地微生物研究所在 Science 杂志上报道了一种自然界中不存在的全新固碳途径 ——CETCH 循环，这是第一条人工合成的固碳途径，同时也是已知六条天然固碳途径之外的第七条固碳途径。
图｜CETCH 循环（来源：Science）
据了解，CETCH 循环以巴豆烯酰辅酶 A 羧化酶作为途径设计的起点，经过 12 步生化反应，最终产物为乙醛酸。相较于其他天然好氧固碳途径而言，CETCH 循环的步骤更短、能效更高，固碳的效率比卡尔文循环高出 20%，是生物固碳领域的一个突破，这项研究意味着采用源于自然的固碳元件也有可能创造出超越自然的非天然固碳途径。
“当时也正是 POAP 循环进行最初设计和定形的阶段，CETCH 循环的出现让我们觉得人工固碳很有意义，坚定了继续做下去的信念。” 肖璐表示。
另外一个是由中国科学院天津工业生物技术研究所设计的人工合成淀粉途径 ——ASAP（The artificial starch anabolic pathway）。目前，淀粉主要由玉米等农作物通过光合作用固定二氧化碳进行合成，其中涉及 60 余步生化反应以及复杂的生理调控，其理论能量转化效率仅为 2% 左右。
ASAP 途径是从头设计出的一条包含 11 步反应的人工合成新途径，利用无机催化剂将氢气与二氧化碳转化为甲醇，通过蛋白质与模块工程构建多步的体外生物酶催化体系并最终合成淀粉。数据显示，ASAP 途径的淀粉合成速率是玉米淀粉合成速率的 8.5 倍，理论能量转化效率是玉米淀粉的 3.5 倍。
图｜ASAP 途径（来源：Science）
ASAP 途径的设计成功意味着未来可以像工业酿造啤酒一样在车间生产淀粉，而不再需要种植玉米等农作物，这将颠覆传统农业，节省超过 90% 的土地和淡水资源，以及肥料、农药等农业生产资料。
谈及人工固碳的产业层面，肖璐表示，现阶段，国内外单纯地利用生物固碳途径的产业尚未形成。“在我看来，人工固碳途径的研究还处于起步阶段，距离产业化还有很长的路要走。” 肖璐表示。“我们设计的 POAP 循环的固碳速率是目前研究领域比较高的，但整体来看依然处于比较低的水平，而且通量也很低，现阶段还处于基础研究阶段。” 她补充到。
据介绍， 国外与固碳相关的产业，大部分都是利用微生物将工业废气 / 尾气转化为生物能源。目前，全球范围已有数家公司实现了基于二氧化碳的商业化生物制造。例如，美国生物技术企业 Algenol 和 LanzaTech 分别利用微藻和梭菌将二氧化碳和一氧化碳转化为生物燃料。
能量供应将是生物固碳的竞争点
近一个世纪以来，化石资源被大量开采和使用，同时以二氧化碳为代表的温室气体排放不断加剧环境污染，各国政府也在相继开发二氧化碳捕获和利用技术进行 “固碳”，以期早日实现 “碳中和”。
“除了加速‘碳中和’的实现，研究生物固碳还将对化工产业、粮食产业等产生积极地影响。” 肖璐表示。
图｜生物固碳对于环境保护意义重大（来源：Pixabay）
比如，很多化学品都是以石油为源头开始加工的，制造过程中污染环境，还会过度消耗石油等不可再生资源。若通过生物固碳途径，通过固定二氧化碳合成有机物进而制造化学品，不仅可以对二氧化碳进行吸收固定，而且还能生产高值有机物。通过生物固碳合成化学品，在未来或许成为生产化学品的重要方向。
再比如，农作物通过光合作用合成淀粉，效率低、周期长、占用土地、耗费资源等。ASAP 途径通过二氧化碳来合成淀粉，一旦发展成熟，未来可以使淀粉的生产走出农业路线。
相较于传统的工业固碳，如何设计和创建高效的生物固碳途径成为全球各国的研究热点。通过生物固碳将二氧化碳进行吸收并转化为化合物，不仅助于环保，而且缓解化石资源消耗，同时还能提供高价值化学品，可谓一举多得。
生物固碳分为 “途径” 和 “能量” 两个层面，诸如固碳循环、固碳酶属于途径层面，而利用氢气中的能量、利用电化学电能等来驱动生化反应，则属于能量层面。
如今，伴随着生物固碳途径设计重构取得了很多进展，解决 “能量供给” 这一限制生物固碳效率因素的紧迫性日益突出。接下来，围绕能量供给方面的优化升级，比如大幅提高固碳过程中对光能的利用率或实现电能的直接利用等，将会是生物固碳领域的竞争焦点。
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