FSHW | 钝顶螺旋藻寡糖的结构表征及其对体外粪便微生物群的影响

Introduction

现如今，越来越多的证据表明肠道微生物群与多种疾病密切相关，包括结直肠癌、代谢综合征、心血管疾病、炎症性肠病、肥胖以及1型和2型糖尿病。很多膳食益生元对宿主健康有益，可选择性地用作刺激肠道微生物群组成和活性的特定变化。多糖与低聚糖由于不易被胃肠道的酶水解的特性而被广泛用作益生元。在大自然中，海藻是发现潜在益生元候选物质多糖或低聚糖的最重要的来源之一，而低聚合度和特定单糖序列的低聚糖似乎更容易被肠道微生物群利用与发酵。相关研究表明，龙须菜生产的琼脂寡糖能够调节细菌群落的多样性，增加了拟杆菌和放线杆菌的相对丰度。海藻酸寡糖增加了有益肠道微生物群的丰度，尤其是乳酸杆菌和双歧杆菌，同时降低了肠杆菌科和肠球菌的丰度。比起物理和化学的制备方法，通过酶法制备的海藻酸低聚糖的益生作用更加多样。此外，海洋微藻低聚糖可以通过多糖糖苷酶，特别是利用海洋细菌中的新型糖苷酶来生产，这将有利于改变多糖结构和生产新型益生元。

螺旋藻是一种食用微藻，长期作为保健和功能食品。螺旋藻具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎、抗糖尿病等多种生物活性。特别是螺旋藻的食用已被证明能促进部分肠道有益微生物群的生长。先前的研究报道，螺旋藻中的活性物质可以调节肠道微生物，改善高脂饲料喂养大鼠的脂质代谢。在螺旋藻的活性物质中，多糖对肠道微生物群表现出了显著的调节作用，不仅可以提高乳酸杆菌属、阿克曼菌属、节线菌属、丁酸单胞菌属、念珠菌属、普氏菌属等有益菌的比例，还可以降低多尔氏菌属、梭菌属等有害菌的比例。然而，关于螺旋藻低聚糖的结构和益生活性的研究却很少。

中国科学院南海海洋研究所Bingna Cai、Peng Wan*等 从海洋微生物酶产生的钝顶螺旋藻中发现并获得了具有全新结构特征的益生元低聚糖，并研究了低聚糖对体外肠道微生物群的益生元作用。此外，还通过重建未观察状态（PICRUSt）对群落进行系统发育研究，预测肠道微生物群功能的变化。

Results and Discussion

SPO的分离和益生元活性评分

通过海洋微生物酶从钝顶螺旋藻制备粗低聚糖SPO，并用DEAE-cellulose-52和Sephadex G-15层析纯化，获得3个组分SPO-1、SPO-2和SPO-3（图1，图2）。副干酪乳杆菌（ATCCSD5275）和动物双歧杆菌（ATCC25527）的SPP和SPO益生元活性得分如表1所示。低聚糖SPO的益生元活性评分显著高于多糖SPP（P＜0.05）。越来越多的临床证据证明，酶解产生的低聚糖具有益生元活性。聚合度低的低聚糖似乎更容易被微生物群发酵。此外，纯化部分SPO-1对两种益生菌菌株的生长具有最强的益生元活性。这一结果可能与不同的结构特征有关，包括分子量、糖残基组成、单糖之间的连接类型和立体化学。选择SPO-1进一步研究结构及其对体外粪便微生物群的影响。

图1 SPO的DEAE-Cellulose-52阴离子交换色谱图

图2 SPO-1、SPO-2和SPO-3的SephadexG-15色谱图

表1 L. paracasei ATCCSD5275和B. animalis ATCC25527的SPP和SPO益生元活性评分

SPO-1的结构表征

用高效液相色谱法测定SPO-1的单糖组成。如图3所示，SPO-1的单糖组成包括葡萄糖和半乳糖，摩尔百分比分别为94.58%和5.42%。结果表明，SPO-1主要由葡萄糖组成，由此证明了它是一种葡聚糖。

图3 单糖标准品和SPO-1的单糖组成的HPLC色谱图

用MALDI-TOFMS测定了低聚糖的分子量，SPO-1的分子量分布范围为510.8～997.0 Da，聚合度为3～5（图4a）。此外，峰间距为162个质量单位，表明SPO-1中含有吡喃糖重复片段单位。结果表明，SPO-1和Na+的m/z为673.2 Da，聚合度为4，因此SPO-1的平均分量为650.2 Da。

图4 SPO-1的MALDI-TOF MS、FT-IR、1H NMR和13C NMR光谱

如图4b所示，SPO-1的FT-IR光谱显示出典型的糖类吸收峰。3286.70 cm-1处的吸收峰为O—H伸缩振动，2900 cm-1处的吸收峰为C—H伸缩振动。在1022.27、1078.21和1145.72 cm-1处的吸收带均为吡喃糖构型的SPO-1。844.82 cm-1处的条带表示α类型的糖苷键。

如1HNMR谱（图4c）所示，δ5.34～5.37处的化学位移为3J1,2偶合常数小于4.0 HZ，表明SPO-1具有α-D-Glu。在13C NMR谱（图5d）中，在δ160.00和δ180.00之间没有发现化学位移，这表明SPO-1中没有羧基。δ99.68、99.53、95.72和91.85（δ＜101）表明SPO-1具有3种不同类型的α构型糖苷键，这与FT-IR分析结果一致。

发酵中碳水化合物的消耗测定

细菌含有许多水解碳水化合物的酶，包括糖基转移酶、糖苷水解酶和碳水化合物酯酶。单糖组成、糖苷键的种类、碳水化合物的分支和寡糖的聚合度影响细菌的利用。如图5所示，粪菌发酵对照组的碳水化合物消耗量在0～12 h呈显著增加趋势，此后增长趋势放缓。发酵12 h后，SPO-1组的碳水化合物消耗率显著高于对照组（P＜0.05）。SPO-1组碳水化合物利用率逐渐提高，24 h时达到（59.49±1.16）%，说明SPO-1可作为碳源和能源，可供粪便微生物群利用。

图5 SPO-1组在不同发酵时间点的碳水化合物消耗比率

SPO-1对肠道菌群的影响

低聚糖的酶促生产通过调节肠道微生物群对肠道系统有益，可作为功能性食品。因此，通过高通量测序分析了低聚糖SPO-1体外发酵后对肠道菌群的影响。稳定的Shannon指数（图6）表明测序数据可以准确地反映样品的微生物群落。

图6 样本的α-多样性分析

在Venn分析（图7a）中比较了微生物群落，OTUs的重叠表明三组中有427个OTUs共存，C24和S24组中有655个OTUs共存。表明样本群落丰富度的Chao和ACE指数在C24和S24组显著高于C0组（表2）。此外，代表群落多样性的S24组的Shannon和Simpson指数显著高于C0组和C24组。这些结果表明，SPO-1可以提高肠道微生物群的丰富度和多样性。如主成分分析（PCA，图7b）和主坐标分析（PCoA，图7c）所示，前两个主坐标分别解释了总样本间方差的99.53%和97.16%，表明发酵后C24和S24到C0组的微生物群落存在显著差异。这一结果也得到了系统聚类树（图7d）和加权UniFrac β-多样性热图分析（图7e）的验证，C24组类似于C0组，其次是S24组。

图7 微生物群落差异分析

表2 不同治疗组的α-多样性

样品成分分布的门水平如图8a所示。 C0组的微生物群主要由厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门组成。 发酵24 h后，拟杆菌门、变形菌门和放线菌门的相对丰度增加，但同时导致C24和S24中拟杆菌门丰度的降低。 热图（图8b）显示了C24组和S24组之间的不同微生物群落。 在属水平上，S24显著促进了小杆菌、拟杆菌、埃希志贺氏菌、巨单胞菌、巨球型菌、布劳特氏菌、柯林斯氏菌、考拉杆菌、双歧杆菌等的相对丰度，而显著降低了 Prevotala_9 和栖粪杆菌的比例。 越来越多的研究表明，拟杆菌、埃希志贺氏菌和巨单胞菌是有益的肠道微生物。 产生单链脂肪酸的类杆菌在免疫系统中起着重要作用，特别是影响肠道共生菌的耐受性。 此外，双歧杆菌和乳杆菌被认为对人类健康有利，这在SPO-1组中的比例要高得多（图8c）。 这些结果表明，SPO-1在体外粪便分批发酵后对微生物群落有一定的调节作用，有利于特定细菌的增殖。

图8 各组（a）门水平细菌分类分析，（b）属水平细菌分布差异热图，（c）不同属丰度变化

低聚糖通过维持肠道内环境的稳定被宿主微生物群选择性地利用来提供健康功能，包括促进有益微生物、抵御病原体、保护胃肠功能和免疫调节。低聚糖的代谢物是由肠道微生物群产生的，在潜在的健康益处中发挥着重要作用。PICRUSt用于预测三组间肠道微生物群的功能变化。如图9a所示，在KEGG一级，加入SPO-1后，差异微生物主要与“新陈代谢”、“遗传信息处理”、“人类疾病”和“机体系统”有关。S24组与其他两组的最大差异是“代谢”、“碳水化合物代谢”和“氨基酸代谢”。在“环境信息处理”中，SPO-1组的信号转导比例显著高于其他两组（图9b）。

图9 （a）C0、C24和S24组肠道微生物群的功能组成，（b）通过Kruskal-Wallis检验在2级期间，三组之间的肠道微生物群KEGG通路发生显着变化

SPO-1对SCFAs产生的影响

许多研究也报道了低聚糖作为益生元，通过增加单链脂肪酸浓度，有益于人类健康。单链脂肪酸，包括醋酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸和异戊酸，在结肠健康中起着重要作用，有利于免疫调节。在表3的发酵过程中，各组的总SCFA水平都有所上升，乙酸、丙酸和正丁酸是主要的发酵产物。对照组总SCFA水平从0 h到6 h迅速升高，12 h和24 h缓慢上升，而SPO-1组从6 h到24 h SCFA总水平仍显著升高，达到（53.09±0.65）mmol/L，表明SPO-1具有调节肠道微环境的作用。经SPO-1发酵24 h后，除丙酸外，其余单链脂肪酸含量均显著高于对照组。在SCFA中，异丁酸和异戊酸在SPO-1组表现出最显著的浓度升高。SPO-1组24 h的异丁酸和异戊酸浓度分别是对照组的12.67倍和24.31倍。因为丁酸是保护结肠黏膜功能的最重要的肠道代谢物，所以SPO-1对人类健康有益。

表3 体外发酵不同时间点发酵液中SCFAs的浓度

Conclusion

综上所述，SPO-1被海洋细菌的糖苷酶水解后，对动物芽孢杆菌ATCC25527显示出极高的益生元活性。SPO-1是葡萄糖通过α-糖苷键连接而成的四糖。SPO-1通过增加群落的丰富度和多样性，显著改善了微生物群落。在属水平上，SPO-1通过增加有益菌种的丰度来调节微生物群组成，包括类杆菌属、大肠杆菌-志贺氏菌属、巨型单胞菌属、巨型藻属、蓝藻属、双歧杆菌属和乳杆菌属。此外，功能分析表明，SPO-1干预后，肠道微生物群主要与“碳水化合物代谢”和“氨基酸代谢”相关。因此，SPO-1有可能作为一种益生元低聚糖，通过调节肠道微生物群，对人类健康和疾病预防起到重要作用。

Structural characterization of oligosaccharide from Spirulina platensis and its effect on the faecal microbiota in vitro

Bingna Caia,b,1, Xiangxi Yic,1, Qian Hanc, Jianyu Pana,d, Hua Chena,b, Huili Suna, Peng Wana,d,*

a Key Laboratory of Tropical Marine Bio-Resources and Ecology/Guangdong Key Laboratory of Marine Materia Medica, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou, 510301 Guangdong, China

b Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory (Guangzhou), Guangzhou, 511458 Guangdong, China

c School of Pharmacy, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning, 530200 Guangxi, China

d Innovation Academy of South China Sea Ecology and Environmental Engineering (ISEE), Chinese Academy of Sciences, Guangzhou, 510000 Guangdong, China

*Corresponding author.

E-mail address: wanpeng@scsio.ac.cn

Abstract

In the present study, an oligosaccharide SPO-1 from Spirulina platensis was prepared by glycosidase from a marine bacterium. The prebiotic activity of SPO-1 on the growth of Lactobacillus paracasei and Bifidobacterium animalis, and its effect on human gut microbiota were examined in vitro. The molecular weight of the tetrasaccharide SPO-1 was 650.2 Da, and it was mainly composed of glucose with α-type glycosidic linkages. The prebiotic activity score of SPO-1 was the highest for the growth of probiotic strains L. paracasei and B. animalis. Furthermore, as fermentation proceeded, SPO-1 was gradually degraded and utilized by intestinal bacteria. The results showed that after treatment with SPO-1, carbohydrate consumption and short-chain fatty acids levels were increased, especially those of i-butyric and i-valeric acids. Moreover, SPO-1 significantly promoted the abundance, diversity and composition of gut microbiota, especially stimulating the growth of Bacteroides, Escherichia-Shigella and Megamonas. In addition, the change in intestinal microbiota function predicted by phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states (PICRUSt) after treatment with SPO-1 is mainly related to the terms “carbohydrate metabolism” and “amino acid metabolism”. These results suggest that SPO-1 is a potential oligosaccharide in regulation of intestinal microbiota.

Reference:

CAI B N, YI X X, HAN Q, et al. Structural characterization of oligosaccharide from Spirulina platensis and its effect on the faecal microbiota in vitro[J]. Food Science and Human Wellness, 2022, 11(1): 109-118. DOI:10.1016/j.fshw.2021.07.012.

编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅

封面图片来源：图虫创意

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