《食品科学》：赤红球菌组氨酸激酶的融合表达和功能分析

组氨酸激酶是一种膜蛋白，它的功能主要发生在双组分系统途径中。在原核生物中，双组分系统通常仅限于两个功能模块之间的通信——组氨酸激酶和反应调控蛋白之间的磷酸化转移。组氨酸激酶是细菌信号转导的中心，它的多样性、多功能性、广泛的分布以及与下游相关组件配合的特殊性，使其成为生物治疗和生物技术操作的重要目标，并成为生物传感器系统工程的基础。

赤红球菌（Rhodococcus ruber）SD3是1 株耐受多种有机溶剂耐受菌，在前期工作中发现在苯酚和甲苯的胁迫下，组氨酸激酶基因的表达均发生下调。为研究组氨酸激酶在R.ruber SD3独特生理特性中的作用，江西师范大学生命科学学院的吴钟昊、彭 仁*通过异源表达得到有活性的组氨酸激酶融合蛋白，并确定组氨酸激酶与R.ruber有机溶剂耐受性之间的关系，旨在为进一步揭示R.ruber SD3中组氨酸激酶涉及的信号转导途径与R.ruber有机溶剂耐受性的关联机制奠定基础。

1、重组质粒pGEX-4T-2-rhks的构建

按原文1.3.4节步骤进行双酶切，回收酶切产物，然后将回收产物进行酶连，转化到BL21（DE3）感受态细胞，筛选得到阳性克隆后进行菌落PCR，电泳结果见图2，条带大小符合预期。送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果与预期基因序列相符，说明表达质粒pGEX-4T-2-rhks构建成功。

2、组氨酸激酶融合蛋白GST-RHK表达条件的优化

如图3所示，组氨酸激酶融合蛋白GST-RHK获得成功表达。同时本实验为了获得更大的表达量，还进行了诱导条件的优化。SDS-PAGE结果表明在OD 600 nm 达到0.6～0.8时加入1 mmol/L IPTG，25 ℃诱导8 h表达量最大（图3）。

3、GST-RHK蛋白的纯化

图4泳道4表明在纯化过程中已将杂蛋白洗涤干净。泳道5～8洗脱液中，第7和第8泳道中对应的洗脱液中有更多的目的蛋白。经谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化，获得电泳纯的GST-RHK融合蛋白，其中纯化倍数为3.1，得率为19.5%（表1）。

4、GST-RHK融合蛋白的LC-MS/MS分析

当设置可信度conf≥95%、Unique peptides≥1时，GST-RHK融合蛋白LC-MS/MS产生的二级谱图数为1 326，解析的二级谱图数为9，蛋白质覆盖率为25.81%。序列显示为绿色其可信度在95%以上（图5）。结果表明纯化得到的蛋白为目的蛋白。

5、GST-RHK融合蛋白的分子质量和酶促反应动力学分析

根据GST-RHK融合蛋白的SDS-PAGE图谱，计算得到GST-RHK融合蛋白的分子质量为72.75 kDa，与理论值72.17 kDa基本一致。采用双倒数作图法，计算得到GST-RHK融合蛋白的K m 和V max 分别为20.92 μmol/L和0.17 μmol/（L·min）（图6），进一步计算得到K cat 值为1.4 min-1。

6、sdrhkE基因增强株和sdrhkD基因敲减株中组氨酸激酶基因的表达情况

如图7所示，与野生型R.ruber相比，sdrhkE基因增强株中组氨酸激酶基因的表达扩大到原来的46.57 倍。sdrhkD基因敲减株组氨酸激酶基因的表达减少到原来的5%。说明增强质粒中的组氨酸激酶基因表达后有效提高了R.ruber中总的组氨酸激酶mRNA含量，然而敲减质粒产生的反义RNA能够和R.ruber基因组产生的组氨酸激酶mRNA结合，从而能够降低组氨酸激酶基因的表达。

7、有机溶剂胁迫下sdrhkE基因增强株和sdrhkD基因敲减株的生长情况

如图8所示，在苯酚、甲苯、氯苯、异辛烷4 种有机溶剂胁迫下，在前24 h内，野生型R.ruber、sdrhkE基因增强株、sdrhkD基因敲减株生长情况区别较小，在24～72 h，上述3 种菌株生长情况呈现差异。其中sdrhkD基因敲减株的生长情况都优于野生型R.ruber SD3，sdrhkE基因增强株的生长情况都低于野生型R.ruber SD3。这些结果表明组氨酸基因表达下调使菌株有机溶剂耐受性增加，然而组氨酸基因表达上调使菌株有机溶剂耐受性下降。

结 论

本研究从R.ruber SD3发现了一种新的组氨酸激酶，证实了其激酶活性，并且它与R.ruber SD3的有机溶剂耐受性存在关联，通过强化或敲减该组氨酸激酶可以改变R.ruber SD3的有机溶剂耐受性，这些研究结果为进一步揭示组氨酸激酶介导的信号转导途径与R.ruber SD3有机溶剂耐受性提供研究依据，也为R.ruber SD3的遗传改造提供了新的靶标。

本文《赤红球菌组氨酸激酶的融合表达和功能分析》来源于《食品科学》2021年42卷22期98-104页，作者：吴钟昊，彭仁，DOI:10.7506/spkx1002-6630-20201007-030。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

图片来源于文章原文及摄图网

为进一步促进动物源食品科学的发展，带动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和提高生活品质，北京食品科学研究院和中国食品杂志社在宁波和西宁成功召开前两届“动物源食品科学与人类健康国际研讨会”的基础上，将与郑州轻工业大学、河南农业大学、河南工业大学、河南科技学院、许昌学院于2022年5月7-8日在河南郑州共同举办“2022年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”。欢迎相关专家、学者、企业家参加此次国际研讨会。