《食品科学》：芥末精油包合物对棘孢曲霉的抑菌机理

红毛丹（Nephelium lappaceum L.）果实风味好且营养价值高，是一种受欢迎的热带水果。然而，红毛丹果实极不耐贮运。一方面，果实表面的软刺气孔密布使果实易出现失水褐变，因此贮运销过程中需保持高湿环境，而高湿情况下更易发生腐烂；另一方面，红毛丹果实软刺极易受损并加速果皮褐变的发生，同时伤口会成为病原菌侵染的通道。芥末精油是从芥菜中提取的天然植物油，其主要成分是异硫氰酸烯丙酯（AITC）。芥末精油或AITC常被用作天然的抑菌剂。

虽然芥末精油或AITC呈现较好的抑菌作用，然而芥末精油或AITC的β-环糊精包合物的抑菌活性鲜有研究，且其抑菌机制鲜有报道。因此，海南大学食品科学与工程学院的李燕妮和中国热带农业科学院海口实验站，海南省香蕉遗传改良重点实验室的李芬芳、袁德保*等人以海南产红毛丹果实褐斑病的病原菌棘孢曲霉为研究对象，考察芥末精油包合物对其抑菌活性和抑菌机制；抑菌机制分别从菌丝、分生孢子和孢子顶囊形态、菌丝细胞超微结构和转录组分析方面开展。研究将为植物精油特别是芥末精油在果蔬采后贮运中的精准保鲜提供理论和技术支撑。

1、芥末精油包合物对棘孢曲霉的抑菌活性

从图1可知，随着质量浓度的增加，芥末精油包合物对棘孢曲霉的抑制率急剧升高。芥末精油对应的抑制率回归方程为y＝42.557x+8.362 4，R ² ＝0.938 9。50%抑制率对应的芥末精油包合物质量浓度为1.00 g/L，即EC 50 为1.00 g/L。多项研究表明植物精油对致病菌有显著抑制作用且呈现明显的量效关系。

2、芥末精油包合物对棘孢曲霉菌丝和分生孢子形态以及孢子顶囊的影响

SEM结果显示，处理组和对照组存在明显差异（图2）。对照组孢子顶囊呈现较规则的球形，分生孢子分布均匀且长势良好；处理组孢子顶囊不匀称且呈畸形，孢子分生不规整（图2A、D）。对照组菌丝较粗且形态饱满，菌丝上布满分生孢子；处理组菌丝较细且发生皱缩（图2B、E）。对照组孢子顶囊的数量显著多于处理组，且处理组孢子顶囊形态发生了明显变化（图2C、F）。

3、芥末精油包合物对棘孢曲霉菌丝细胞超微结构的影响

TEM结果显示，对照组菌丝细胞饱满、双层膜结构明显，可见内质网、核糖体以及正在进行跨膜运输的囊泡等细胞器（图3A）；处理组菌丝细胞不再充盈、细胞壁变薄、细胞膜边界模糊、细胞内部发生严重的溶解现象（图3B）。

4、棘孢曲霉差异表达基因的分析

为进一步探究精油的抑菌机制，一些文献通过转录组学手段研究了精油对真菌DEGs的影响。对处理组和对照组样品的转录组测序数据进行标准化处理，然后对所有基因的表达量绘制散点图（图4A）。灰色部分表示差异不显著的DEGs；红色和绿色部分分别表示DEGs中的上调基因和下调基因。由图4B可知，DSGs中上调基因和下调基因分别为528 个和529 个。由图4C可知，DEGs的GO功能富集主要集中在生物过程（14 条）、细胞组成（12 条）和分子功能（15 条）3 个方面。1 057 个DEGs中，有743 个基因成功归类到3 个部分中的41 个组别中（图4C）。

在生物过程方面，DEGs主要参与了“代谢过程”“细胞过程”“本土化”“生物调节”等过程；在细胞组成方面，DEGs主要参与了“膜部分”“细胞区域”“细胞器”“蛋白复合物”等；在分子功能方面，DEGs主要参与了“催化活性”“结合”“转运活性”“翻译调节活性”等。进一步分析DEGs的KEGG途径分类，主要归于“代谢”“遗传信息处理”“环境信息处理”“细胞转化”“有机体系统”“人类疾病”6 类（图4D）；共有392 个DEGs归类到29 条KEGG途径，主要涉及“碳水化合物代谢”“氨基酸代谢”“能量代谢”“折叠、分类和降解”“翻译”“信号转导”“运输和分解代谢”“环境适应”等（图4D）。

5、实时荧光定量PCR验证实验结果

基于GO和KEEG富集分析，选取各条目和代谢通路中显著变化且表达量较多的8 个差异基因，利用实时荧光定量PCR对选取的基因差异表达情况进行验证。选取基因主要参与编码ATP合成酶、NADPH结合酶以及细胞色素c氧化酶亚基1等。虽然转录组测序结果和实时荧光定量PCR分析结果的log2FC有差异，但差异表达的变化趋势基本一致（表2），说明转录组测序数据的可靠性；表达倍数的差异可能是由于仪器、算法等不同造成的。

6、基于转录组数据的芥末精油包合物抑制棘孢曲霉机制分析

1

芥末精油包合物对参与细胞结构基因表达的影响

线粒体膜相关的基因中出现6 个显著上调、13 个显著下调；线粒体内膜相关的基因中出现4 个显著上调、11 个显著下调；细胞器内膜相关的基因中出现4 个显著上调、11 个显著下调（表3）。控制生物膜形成的基因显著下调，说明膜的完整性遭到破坏。编码线粒体内膜蛋白复合物的基因中出现2 个上调，7 个下调（表3）。

2

芥末精油包合物对参与DNA/RNA合成代谢、运输能力以及有丝分裂的影响

核酸结合转录因子活性相关基因出现39 个上调、34 个下调；转录因子活性（序列特异性DNA结合）相关基因出现39 个上调、34 个下调；RNA聚合酶II转录因子活性（序列特异性DNA结合）相关基因出现38 个上调、32 个下调（表4）。上述结果表明芥末精油包合物处理对棘孢曲霉DNA和RNA的生物合成和代谢造成了显著影响，进而使蛋白质合成和功能受限。跨膜转运相关基因出现40 个上调、31 个下调；无机阳离子跨膜转运相关基因出现10 个上调、15 个下调；单价无机阳离子跨膜转运相关基因出现7 个上调、13 个下调；氢离子跨膜转运相关基因出现7 个上调、12 个下调（表4）。综上可知，芥末精油包合物处理显著影响了棘孢曲霉体内跨膜运输调节，跨膜信号转导紊乱进一步影响细胞的正常生理功能。

3

芥末精油包合物对酶活性相关基因表达的影响

糖苷水解酶活性相关基因出现22 个上调、17 个下调（表5）。结果可知，芥末精油包合物处理对棘孢曲霉体内酶活性相关的基因转录水平产生了显著影响，酶活性的变化直接或间接影响了生物大分子的功能、代谢反应的发生、细胞进程的改变。

4

芥末精油包合物对呼吸电子传递链相关基因表达的影响

黄素腺嘌呤二核苷酸结合相关基因出现30 个上调、15 个下调；呼吸电子传递链相关基因出现4 个上调、9 个下调；需氧呼吸相关基因出现2 个上调、5 个下调；细胞呼吸相关基因出现2 个上调、5 个下调；氧化磷酸化相关基因出现1 个上调、3 个下调；细胞色素复合物相关基因出现2 个上调、6 个下调；线粒体呼吸链复合物相关基因出现1 个上调、3 个下调；质子转运两扇区相关基因出现1 个上调、3 个下调（表6）。

结论

芥末精油包合物具有抑制棘孢曲霉的良好活性且存在明显量效关系，其EC 50 为1.00 g/L；SEM观察发现EC 50 下芥末精油包合物使棘孢曲霉菌丝、分生孢子及孢子形态发生明显变化且孢子顶囊数量大幅减少；TEM观察结果表明EC 50 的芥末精油包合物使棘孢曲霉菌丝细胞的细胞壁、细胞膜以及细胞器出现异常。芥末精油包合物处理后，棘孢曲霉线粒体膜等生物膜受损、细胞成分改变、细胞骨架等细胞器形成和功能发生变化；DNA和RNA的生物合成和代谢受到显著影响；酶活性相关基因、跨膜运输调节相关基因受到显著影响；有丝分裂过程受到严重抑制从而抑制体细胞产生；呼吸电子传递链及能量代谢水平受到显著抑制。

本文《芥末精油包合物对棘孢曲霉的抑菌机理》来源于《食品科学》2021年42卷21期63-71页，作者：李燕妮，李芬芳，陈娇，李奕星，刘石生，洪克前，冯建成，袁德保。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20201124-243。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

图片来源于文章原文及摄图网

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