基因下调老无效？从方案设计到实操，教你避开实验中的「坑」

基因干扰技术在基因功能研究有着广泛应用，但我们自己在进行方案设计的时候，却面临着很实际的问题：选了 RNAi，担心脱靶，选了 CRISPR 又担心操作和设计太过复杂。怎样选择合适自己的方法？又怎样避开实验过程中的「坑」？是大家共同关心的问题。

丁香园联合吉凯生物，邀请到了一位基因调控方案设计的「老司机」，为大家带来「基因下调方法设计及分子克隆构建」专题讲座，价值千元的讲座课程0 元领取，手把手教你进行基因下调设计，和「隐藏 bug」说 bye bye~

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（讲座之后，奉上基因下调无效的解决思路~）

讲座时间：9 月 22 日 15:30

讲座内容

●基因下调技术（RNAi，CRISPAR-KRAB，CRISPAR-KO）及适用范围；

● 如何进行「基因分析、靶点设计、blast 比对」；

● 分子克隆全攻略：载体分析及短序列分子克隆实操；

● 基因下调研究中常见问题盘点；

以下为基因下调无效的解决思路~

目前，基因调控主要通过 RNAi 或者 Crispr/cas9 两种途径实现，这两大技术已经发展完善，应用也非常广阔，但即便如此，也没有任意一家公司能够提供 100%有效的商业化靶点。换言之，基因的 knockdown 或者 knockout 并不简单，这是为何呢？

因为靶点的有效性受限于众多因素，以 RNAi 为例，影响靶点的因素包括：

01

基因的表达水平

表达越低，敲减越难；

02

RNA的二级结构

RNA 本身是单链的，其序列某些区域可能互补，靶点就无法结合；

03

载体结构

不同骨架的载体，表达 shRNA 的水平是有差异的；

04

细胞系差异

同一个靶点，在不同细胞的敲减效率是有差异的；

那么，如何提升靶点有效性，避免无效呢？让我们看看其他科研工作者是如何解决这个问题的吧：

1

长片段基因下调

针对 mRNA、circRNA、lncRNA 这类片段普遍较长的分子，可以由原本的单靶点替换为多靶点 KD/KO，具体实验方案如下：

新思路-多靶点串联验证

Weng1等人针对红色荧光设计了三个靶点，分别构建进入 U6 启动子的载体，同时构建了一个三个靶点串联在一起的载体，并转入带有红色荧光的细胞：

随后，从荧光强度、RNA 水平表达活性、WB 水平表达程度三个维度分析，发现三个靶点串联的 DsRed-3shRNA 下调基因的水平都优于三个单独的 shRNA，证实了，多靶点串联的优越性：

dsRed 是外源转入细胞并敲低的，那针对内源性基因，敲低效果如何呢？作者选择卵巢癌细胞高表达的 Akt2 作为靶标，设计单个靶点、双靶点串联、三靶点串联的三种病毒组合，分别感染细胞，结果如下：

上述针对不同基因设计靶点串联构建的形式，在动物水平应用更加广泛。

因为单只动物某一部位注射的病毒量、体积都是受限的，若要同时操作多个基因，难度更大，而多靶点串联对于基因下调则是优选，Platt3 等人使用单个 aav 病毒，运用 cas9 的方式敲除肺腺癌中前三个显着突变的基因 KRAS、p53 和 LKB1，从而建立了疾病模型：

同时敲三个基因，只需要一个病毒即可，是不是十分经济而有效呢？

2

短片段基因下调

针对 miRNA、piRNA、tsRNA 这类序列在 20bp 左右的小分子，当前下调手段主要为合成或表达其反义互补序列。以 miRNA 为例，很多研究者发现，下调后 miRNA 的 QPCR 水平却没有变化，这是怎么回事呢？

《RNA Biology》上一篇文章对于 miRNA 反义核酸的描述如下：

翻译一下：

由上我们可以得知，miRNA 反义序列只是抑制功能，并不能有效降解 miRNA，即便未检测到，正确的做法是直接检测目的基因蛋白水平是否有上调。但若实验者不清楚靶基因的情况下，没有检测到 miRNA 下调，心里便是没底的，那又如何解决呢？？？

答案是，反义核酸是在转录后水平发挥功能，要阻断 miRNA 的产生，理想情况是在生成成熟的 miRNA 之前阻断。此要求目前唯有 CRISPR / Cas9 能实现，Cas9 通过在 pre-miRNA 序列中引入突变，从而破坏 miRNA 表达，是 miRNA 基因功能缺失研究的一种新方法，以下案例可以帮助大家更好地理解：

（1）案例一

福建肖老师运用 Cas9 技术，针对 miR-21 基因设计 sgRNA ，通过慢病毒递送细胞，并在 RNA 水平检测到 mir-21 的下调表达，从而研究出 miR-21 耗竭对 CNE2 鼻咽癌（NPC）细胞生物学特性及其潜在机制的影响。

A.miR-21 敲除靶点；B、C. 基因组设计引物扩增 DNA 并进行 T7EN1 酶检测编辑效率;B. D.QPCR 检测成熟体表达水平

使用 Cas9 敲除 miR-21 之后，功能上也呈现出阳性：

（A-D）miR-21 敲除削弱了 CNE2 细胞的生长，侵袭和迁移能力

（2）案例二

此外，温医大第一医院的张老师使用 Cas9 敲除 mir-545，研究了人环状RNA PRKCI（circPRKCI）通过抑制 miR-545 显示致癌性，促进人类神经胶质瘤细胞的病理进展。

J. miR-545 敲除后的表达水平（Cas9-C 为对照）

所以，CRISPR / Cas9 对于 miRNA 的 KO 是有效的、被认可的、且以 QPCR 检测表达量完全没有问题。

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内容审核：周育红、潘成

题图来源：图虫创意

文章来源：吉凯基因

参考文献：

[1] A multi-shRNA vector enhances the silencing efficiency of exogenous and endogenous genes in human cells

[2] A simple approach for multi-targeted shRNA-mediated inducible knockdowns using Sleeping Beauty vectors

[3] CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling

[4] MicroRNA-21 depletion by CRISPR/Cas9 in CNE2 nasopharyngeal cells hinders proliferation and induces apoptosis by targeting the PI3K/AKT/MOTOR signaling pathway

[5] Anti-miRNA oligonucleotides: A comprehensive guide for design

[6] Lentiviral CRISPR/Cas9 vector mediated miR-21 gene editing inhibits the epithelial to mesenchymal transition in ovarian cancer cells

[7] Circular RNA PRKCI promotes glioma cell progression by inhibiting microRNA-545