张华伟/刘利静合作建立拟南芥基因编辑突变体高效筛选体系

来源 | 北大现代农业研究院

以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑工具在动植物的基础研究和应用领域引领了革命性的突破。模式植物拟南芥中基因编辑突变体的筛选和功能研究，可以有效推进植物基础研究进展。最初由35S和RPS5A启动子为代表的组成型启动子驱动Cas9产生的拟南芥突变体大多数是嵌合突变体，很多突变形式不可遗传，后代的鉴定也比较繁琐，尤其是多突变体鉴定。由于拟南芥浸花转化的特点，使用卵母细胞特异EC1启动子表达Cas9产生的突变体可以有效降低嵌合突变体的比率，但是该体系整体突变率较低，需要进一步提高突变或者筛选效率。

北京大学现代农业研究院张华伟课题组和山东大学刘利静课题组的研究人员，开发了一种可视化的GL2突变辅助筛选系统(GL2 mutation-based visible selection, GBVS)。该系统在编辑目的基因的同时编辑调控植物叶片和茎干表皮毛发育的GLABRA2 (GL2)基因，在转化后代中挑选GL2位点发生编辑的无毛植物，再进行目的位点的鉴定。研究结果发现，GBVS显著提高了靶基因的突变筛选效率（增加了2.58-7.50倍）。通过GBVS系统筛选的T1植株中有25%-48.15%为纯合或双等位基因突变体，比原始系统选择效率高1.71-7.86倍(图1)。通过这些突变体的后代检测，发现这些纯合或双等位基因突变体均可遗传。证实此系统可以显著提高拟南芥突变体筛选效率。

图1: GBVS可以有效提高拟南芥基因编辑突变体筛选效率

此外，研究人员证实GL2突变对大多数目的基因的功能研究没有显著影响。研究挑选了参与茉莉酸JA信号途径的JAZ1、赤霉素信号途经的GAI、种皮颜色形成的TT4和植物花器官发育的AP1作为靶基因，发现获得的突变体仍然适合功能分析 (图2)。

图2：GBVS系统筛选得到的突变体适合进行功能研究

基因编辑系统的优势之一是能够一代靶向多个位点，研究人员通过对ABA受体家族中的3个成员基因（PYR1、PYL1和PYL2）进行靶向突变以检测GBVS的有效性。在得到的128棵T1植物中，15棵显示了无毛表型。这15棵拟南芥中，5棵显示所有靶位点发生突变，其中4棵为非嵌合体突变体（26.67%），其中1棵三个基因被完全敲除（6.67%）。在高效率的PYR1和PYL1靶点处，12棵为两个靶点纯合或双等位突变(80%)。相比较而言，在随机挑选的20棵有表皮毛植株中，只有3棵在三个位点均有编辑，PYR1和PYL1靶点处也只有2棵为两个靶点纯合或双等位突变 (图3)。

图3：GBVS系统的多基因编辑分析。A：PYR1、PYL1和PYL2多基因突变载体示意图。B：15棵无毛T1植物的编辑结果分析。C：随机挑选20棵有表皮毛T1后代的编辑结果分析。

该研究证实了共编辑筛选，尤其是GBVS共筛选系统在突变体筛选鉴定上的有效性，可以有效减少基因编辑突变体筛选消耗的人力物力。此外，文章也讨论了其它共筛选标记和这些筛选标记的优缺点。

相关研究结果于2021年7月24日以GLABRA2-based selection efficiently enriches Cas9-generated non-chimeric mutants in the T1 generation为题在线发表于Plant Physiology上。

山东大学刘利静课题组博士后孔祥久和北京大学现代农业研究院张华伟研究组潘文波为该论文的第一作者，张华伟研究员和刘利静教授为共同通讯作者。相关研究得到泰山学者青年专家、山东省省级科技创新基金、山东省基金委和山东大学齐鲁青年学者等的资助。

论文链接：

https://doi.org/10.1093/plphys/kiab356